對(duì)小鼠黑色素移植瘤血管生成擬態(tài)中作用的研究

1、對(duì)小鼠黑色素移植瘤血管生成擬態(tài)中作用的研究張凡孫保存常永霞趙秀蘭【摘要】目的：利用小鼠移植瘤模型動(dòng)態(tài)觀察D31、P2、P9、athepsinD在惡性黑色素移植瘤血管生成擬態(tài)形成中的作用。方法：采用B16黑色素瘤細(xì)胞株制作小鼠惡性黑色素移植瘤動(dòng)物模型，成瘤后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表每天隨機(jī)抽取一只小鼠處死，共12d，獲得腫瘤樣本114例；HE染色、D31、athepsinD、P2、P9、HB45免疫組織化學(xué)染色和PAS染色；分別計(jì)數(shù)血管生成擬態(tài)周?chē)斑h(yuǎn)離血管生成擬態(tài)區(qū)域腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞百分率；內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)斑h(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管區(qū)域腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性百分率；連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野并取其均值。結(jié)果：在惡性黑

2、色素移植瘤形成的第18天，腫瘤組織內(nèi)存在血管生成擬態(tài)；第912天移植瘤中的血管生成擬態(tài)被內(nèi)皮依賴(lài)性血管替代；血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞中D31、P2陽(yáng)性細(xì)胞百分率高于遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)區(qū)域的陽(yáng)性細(xì)胞百分率;內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞D31陽(yáng)性細(xì)胞百分率與遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管區(qū)域的陽(yáng)性細(xì)胞百分率之間存在明顯差異；血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞P9陽(yáng)性細(xì)胞百分率高于內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)年?yáng)性細(xì)胞百分率；血管生成擬態(tài)密度與血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞D31、athepsinD、P2陽(yáng)性細(xì)胞百分率之間存在相關(guān)，與腫瘤細(xì)胞中P9陽(yáng)性細(xì)胞百分率之間不存在相關(guān)；內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度只與內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞中D31陽(yáng)性百分

3、率之間存在相關(guān)，與athepsinD、P9、P2之間不存在相關(guān)。結(jié)論：惡性黑色素瘤移植瘤中血管生成擬態(tài)與內(nèi)皮依賴(lài)性血管共存，且與內(nèi)皮依賴(lài)性血管之間存在一定的時(shí)空變化規(guī)律。D31、athepsinD、P2、P9、HB45等參與了黑色素瘤血管生成擬態(tài)的形成，其中D31、P2作用尤其重要?！娟P(guān)鍵詞】血管生成擬態(tài);腫瘤血管生成;細(xì)胞粘附分子;惡性黑色素瘤;基質(zhì)金屬蛋白酶【KEYRDS】Vasulgeniiiry;Angigenesis;elladhesinleule;alignantlena;atrixetallprtEinase血管生成擬態(tài)是1999年美國(guó)las大學(xué)的anitis和Flberg等根據(jù)

4、他們對(duì)眼葡萄膜惡性黑色素瘤微循環(huán)的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)的一種與傳統(tǒng)的腫瘤血管生成途徑完全不同的、不依賴(lài)內(nèi)皮細(xì)胞的全新的腫瘤細(xì)胞的血液供給方式16。惡性黑色素瘤細(xì)胞通過(guò)自身變形和與細(xì)胞外基質(zhì)互相作用，模擬血管壁構(gòu)造形成可輸送血液的管道，從而重塑腫瘤的微循環(huán)，并且與宿主血管相連通，使腫瘤獲得血液供給，命名為血管生成擬態(tài)。這種特殊的腫瘤血供形式與內(nèi)皮依賴(lài)性血管的生成在很多方面存在不同。研究證實(shí)具有血管生成擬態(tài)的腫瘤惡性度高，生長(zhǎng)迅速，易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移。本研究在以前實(shí)驗(yàn)的根底上首次提出了血管生成擬態(tài)的時(shí)空變化概念：即血管生成擬態(tài)是腫瘤血液供給的一種暫時(shí)性替代形式，在腫瘤發(fā)生開(kāi)展的一定時(shí)期內(nèi)存在，在腫瘤的不同區(qū)

5、域存在不同的變化趨勢(shì)。本研究的前期實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠的惡性黑色素移植瘤模型，初步驗(yàn)證了我們提出的假說(shuō)。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)方法對(duì)血管生成擬態(tài)的形成機(jī)制以及與內(nèi)皮依賴(lài)性血管之間的聯(lián)絡(luò)做進(jìn)一步的討論，深化提醒兩者之間的變化規(guī)律。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：57小鼠購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物室，68周齡，共20只，雌雄各半，體重2530g，編號(hào)后干凈實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飲用水和飼料由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2實(shí)驗(yàn)方法：先將黑色素瘤細(xì)胞株B16復(fù)蘇，1640細(xì)胞培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d，使細(xì)胞排滿瓶底，0.2%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度到達(dá)1107/l。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射0

6、.2l細(xì)胞懸液。10d后接種部位開(kāi)場(chǎng)出現(xiàn)皮下腫塊。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表每天抽取一只小鼠處死，共持續(xù)12d。解剖并仔細(xì)檢查動(dòng)物全身，共獲得腫瘤樣本114例。全部標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，然后常規(guī)石蠟包埋。1.3染色方法1.3.1試劑：一抗D31、HB45為鼠抗小鼠單克隆抗體，即用型，6l包裝，SNATARUZ消費(fèi)，進(jìn)口分裝；athepsinD、P2、P9兔抗多克隆抗體，濃縮型，0.1l包裝，購(gòu)自武漢博士德試劑公司；二抗、三抗為SP復(fù)合物和山羊抗兔PV6001，購(gòu)自北京中山試劑公司。PAS液為天津腫瘤醫(yī)院病理室自行配制。1.3.2主要免疫組化步驟：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶

7、，PBS緩沖液振洗，抗原微波熱修復(fù)，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過(guò)夜，二抗、三抗各1hDAB顯色1015in，復(fù)染核脫水透明，中性樹(shù)膠封片。1.3.3D31、PAS雙重染色：先挑選2例正常胃粘膜樣本進(jìn)展對(duì)照染色，分泌粘液處均染成櫻桃紅色，證實(shí)PAS試劑質(zhì)量可靠。先按照SP法進(jìn)展D31免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色后顯微鏡下觀察，待血管內(nèi)皮細(xì)胞著棕黃色后水沖數(shù)分鐘終止顯色，然后用0.5%高碘酸溶液復(fù)原切片10in，時(shí)間切不可過(guò)長(zhǎng)以防止出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。水流沖洗數(shù)分鐘后置于shiff液中，避光1015in，自來(lái)水沖洗，顯微鏡下觀察出現(xiàn)櫻桃紅色，蘇木素淺染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)后，梯度酒精脫水，二

8、甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。1.4計(jì)算機(jī)圖象處理使用空軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程研究所的BINDAFIG圖象采集處理系統(tǒng)計(jì)算每張切片中壞死面積。1.5計(jì)數(shù)方法1.5.1區(qū)域劃分：中央?yún)^(qū)與外周區(qū)的劃分：避開(kāi)腫瘤壞死,將每張切片中腫瘤組織鏡下視野均勻分成三等份，即內(nèi)1/3、中1/3、外1/3三個(gè)區(qū)域，內(nèi)1/3區(qū)域即為中央?yún)^(qū)，外1/3即為外周區(qū)。血管生成擬態(tài)周?chē)c遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)c遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的劃分：以血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴(lài)性血管為中心的高倍視野定義為血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)?；間隔 上述視野一個(gè)高倍視野的腫瘤細(xì)胞即為遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮依賴(lài)性血管。血管生成擬態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)內(nèi)皮細(xì)

9、胞襯復(fù)的PAS陽(yáng)性管道、襯復(fù)PAS陽(yáng)性物質(zhì)的腫瘤細(xì)胞圍成不規(guī)那么管腔，且管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，周?chē)鷽](méi)有出血壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。1.5.2計(jì)數(shù)方法：低倍鏡下找到血管生成擬態(tài)和內(nèi)皮依賴(lài)性血管存在的典型區(qū)域，換成高倍鏡400，連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野內(nèi)的血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮依賴(lài)性血管，取其均值即為血管生成擬態(tài)密度、內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度。同時(shí)計(jì)數(shù)血管生成擬態(tài)周?chē)?、?nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)?、遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)、遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的腫瘤細(xì)胞中各種指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)各項(xiàng)指標(biāo)均連續(xù)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野內(nèi)隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均值。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：2結(jié)果2.1常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察腫瘤直徑1.54，大體為黑色

10、，外表可見(jiàn)豐富的血管，與周?chē)拗鹘M織分界不清，呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)，切面呈黑紅色,實(shí)性、質(zhì)地柔軟有光澤，部分區(qū)域散在出血壞死?？梢?jiàn)腫瘤細(xì)胞圍成的不規(guī)那么的管腔，腔內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞，即血管生成擬態(tài)，而且與內(nèi)皮依賴(lài)性血管共存現(xiàn)象，共26例。內(nèi)皮依賴(lài)性血管多位于移植瘤外周區(qū)并與正常組織相交界。中央?yún)^(qū)血管生成擬態(tài)較多見(jiàn)，外周區(qū)血管生成擬態(tài)較少。早期腫瘤壞死較少，且多為點(diǎn)狀壞死、局灶性壞死，后期腫瘤組織中央出現(xiàn)區(qū)域壞死，將腫瘤組織分割成多個(gè)孤立的細(xì)胞巢。2.2腫瘤組織內(nèi)的血管生成擬態(tài)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)通過(guò)D31和PAS雙重染色，在該移植瘤的第18天可見(jiàn)到典型的血管生成擬態(tài)樣構(gòu)造：外層為D31染色陰性的腫瘤細(xì)胞，內(nèi)襯櫻桃紅色

11、的PAS陽(yáng)性物質(zhì)，管腔內(nèi)有成堆的紅細(xì)胞,這種構(gòu)造在第912天被內(nèi)皮依賴(lài)性血管所替代。我們的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)有的血管生成擬態(tài)中腫瘤細(xì)胞圍成的不規(guī)那么管腔內(nèi)無(wú)PAS陽(yáng)性物質(zhì)襯復(fù)，同時(shí)管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞。我們以前實(shí)驗(yàn)證實(shí)人惡性黑色素瘤細(xì)胞能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞抗原D31和PAS陽(yáng)性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象,鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)D31抗原位于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈均質(zhì)或細(xì)顆粒狀,且呈現(xiàn)高表達(dá)。PAS陽(yáng)性物質(zhì)那么呈顆粒狀或團(tuán)塊狀分布在腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)，甚至有的單個(gè)腫瘤細(xì)胞外周有一層PAS陽(yáng)性物質(zhì)環(huán)繞，或幾個(gè)腫瘤細(xì)胞外有一圈PAS陽(yáng)性物質(zhì)。2.3各種指標(biāo)在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá)變化規(guī)律2.3.1D31在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá)顯微鏡下觀

12、察發(fā)現(xiàn)部分的腫瘤細(xì)胞表達(dá)D31抗原，同時(shí)圍成血管生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或極少表達(dá)D31抗原，血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞高表達(dá)D31抗原。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞D31的表達(dá)高于遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞的D31表達(dá)高于遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞D31的表達(dá)與內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞表達(dá)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見(jiàn)表1。表1D31在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá)個(gè)/高倍視野區(qū)域腫瘤數(shù)中位數(shù)ZAsypsig血管生成擬態(tài)周?chē)鷧^(qū)262.56.1910.001遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)區(qū)261.55.4390.003內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)鷧^(qū)1143.

13、03.1500.250遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管區(qū)1141.72.3.2P2在腫瘤不同區(qū)域的陽(yáng)性表達(dá)血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞P2表達(dá)高于遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞的表達(dá)；內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)c遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的腫瘤細(xì)胞P2的陽(yáng)性表達(dá)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞P2的表達(dá)與內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞表達(dá)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見(jiàn)表2。2.3.3P9在腫瘤不同區(qū)域的表達(dá)血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞與遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)腫瘤細(xì)胞P9的表達(dá)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，內(nèi)皮依賴(lài)性血管與遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的腫瘤細(xì)胞的P9表達(dá)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞P9的陽(yáng)性表達(dá)高于內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)

14、胞的表達(dá)見(jiàn)表3。2.3.4athepsinD在腫瘤不同區(qū)域的陽(yáng)性表達(dá)血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞與遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞athepsinD的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)c遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的腫瘤細(xì)胞athepsinD表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞athepsinD的表達(dá)高于內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)哪[瘤細(xì)胞的表達(dá)見(jiàn)表4。表2P2在腫瘤不同區(qū)域的陽(yáng)性表達(dá)個(gè)/高倍視野表3P9在腫瘤不同區(qū)域的陽(yáng)性表達(dá)個(gè)/高倍視野表4athepsinD在腫瘤不同區(qū)域的陽(yáng)性表達(dá)個(gè)/高倍視野2.4血管生成擬態(tài)密度與血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞各免疫組化指標(biāo)之間的相關(guān)分析表5血管生成擬態(tài)密度與周?chē)[瘤細(xì)

15、胞陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)分析從上表我們可以看出血管生成擬態(tài)密度與其周?chē)[瘤細(xì)胞D31、P2的陽(yáng)性表達(dá)之間存在親密相關(guān)，與其周?chē)[瘤細(xì)胞athepsinD、P9的陽(yáng)性表達(dá)之間不存在相關(guān)。2.5內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度與周?chē)[瘤細(xì)胞各免疫組化指標(biāo)之間的相關(guān)分析從下表可以看出，內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度與其周?chē)[瘤細(xì)胞D31表達(dá)之間存在相關(guān)，與其它指標(biāo)之間不存在相關(guān)見(jiàn)表6。表6內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度與周?chē)[瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)分析2.6血管生成擬態(tài)密度、內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度和腫瘤壞死之間的關(guān)系顯微鏡下觀察我們可以看到，早期腫瘤組織內(nèi)血管生成擬態(tài)密度較高，壞死較少見(jiàn)，多為小灶性壞死，后期腫瘤組織內(nèi)血管生成擬態(tài)密度降低，壞死逐漸增

16、多，且多為片狀壞死，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，血管生成擬態(tài)密度與腫瘤組織的壞死之間存在相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.978，內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度與腫瘤壞死之間亦存在相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.230，證明在該腫瘤中血管生成擬態(tài)對(duì)維持腫瘤生長(zhǎng)起到重要作用見(jiàn)表7。表7血管生成擬態(tài)密度、內(nèi)皮依賴(lài)性血管密度與壞死之間的相關(guān)3討論血管生成擬態(tài)是一種全新的、沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞參與的腫瘤血液供給形式，已有的研究證實(shí)多種腫瘤炎性乳癌、浸潤(rùn)性卵巢癌、前列腺癌中存在血管生成擬態(tài)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)由于這些腫瘤血液供給的特殊性，可以便利克制腫瘤快速生長(zhǎng)過(guò)程中的缺血、缺氧狀況，惡性程度高、生長(zhǎng)迅速、極易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移，因此深化研究血管生成擬態(tài)的分子機(jī)制

17、對(duì)上述腫瘤的抗血管治療具有重要意義。我們的研究中發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)只是在惡性黑色素移植瘤的一段時(shí)期內(nèi)與內(nèi)皮依賴(lài)性血管共存，說(shuō)明該構(gòu)造是一種暫時(shí)性的血液供給形式，與內(nèi)皮依賴(lài)性血管之間存在一定的演變規(guī)律，我們首次提出了血管生成擬態(tài)的時(shí)空變化概念，前期實(shí)驗(yàn)部分驗(yàn)證了我們的假說(shuō)。腫瘤血管形成是在多種促血管生成因子的刺激下，腫瘤血管生成開(kāi)關(guān)機(jī)制失衡，內(nèi)皮細(xì)胞由靜止轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)，打破基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)，增生形成內(nèi)皮細(xì)胞條索，然后通過(guò)基質(zhì)重塑形成完好的血管網(wǎng)。血管生成擬態(tài)那么是腫瘤細(xì)胞利用自身的變形，模擬內(nèi)皮細(xì)胞互相連接粘附，并與細(xì)胞外基質(zhì)互相作用，借助多種蛋白酶的作用使部分細(xì)胞外基質(zhì)重塑，形成由腫瘤細(xì)

18、胞彼此連接的不規(guī)那么管腔，我們實(shí)驗(yàn)中的PAS染色有力的證明腫瘤細(xì)胞模擬內(nèi)皮依賴(lài)性血管的構(gòu)造。盡管兩者形成的機(jī)制有所不同，但是兩者的形成過(guò)程中都涉及到細(xì)胞外表的粘附分子和與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移存在親密關(guān)系的蛋白酶類(lèi)。國(guó)外的文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)：能形成血管生成擬態(tài)的惡性黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞粘附分子血管-內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘附蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)P2、T1-P表達(dá)程度在形成血管生成擬態(tài)的區(qū)域內(nèi)升高。我們的實(shí)驗(yàn)就是通過(guò)免疫組化檢測(cè)血管生成擬態(tài)周?chē)蛢?nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞外表粘附分子D31和蛋白酶類(lèi)P2、P9、組織蛋白酶D等的表達(dá)，研究?jī)?nèi)皮依賴(lài)性血管和血管生成擬態(tài)在腫瘤發(fā)生開(kāi)展過(guò)程中的變化，同時(shí)進(jìn)一步深化研究和完善血管生成

19、擬態(tài)的分子機(jī)制。腫瘤細(xì)胞在形成血管生成擬態(tài)的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)互相作用，獲取細(xì)胞外微環(huán)境中信息，并使細(xì)胞外蛋白水解、重塑，排列形成可以運(yùn)送血液的管道樣構(gòu)造，因此多種細(xì)胞外基質(zhì)中與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白酶必然參與其中。Ps是一族至少包括19類(lèi)的鋅依賴(lài)性內(nèi)肽酶，它們的共同作用是可降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分。Ps主要以酶原形式分泌到細(xì)胞外，一般情況下它們與組織金屬蛋白酶抑制劑TIPs以11比例結(jié)合形成復(fù)合物。體內(nèi)的Ps具有基因轉(zhuǎn)錄程度、翻譯后程度調(diào)節(jié)。P2和P9分子量分別為72Kda和92KDa，是兩種重要的蛋白酶，與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移親密相關(guān)。因此我們對(duì)黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)展P2和P9免疫組化染色

20、，P2陽(yáng)性率為74/11470%，P9陽(yáng)性率為67/11458%，與國(guó)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。同時(shí)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)P2和P9在血管生成擬態(tài)生成的早期第4、5天出現(xiàn)高表達(dá)，國(guó)外學(xué)者的研究發(fā)如今黑色素瘤形成的初期P9的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，提示P9表達(dá)與早期黑色素瘤的浸潤(rùn)有關(guān)，也有報(bào)道稱(chēng)P9出如今進(jìn)展期黑色素瘤中，而不是在早期。研究發(fā)現(xiàn)擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞P2的表達(dá)高于遠(yuǎn)離擬態(tài)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，內(nèi)皮依賴(lài)血管周?chē)哪[瘤細(xì)胞P2的表達(dá)與遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)血管的表達(dá)之間無(wú)明顯差異，血管生成擬態(tài)與內(nèi)皮依賴(lài)血管周?chē)[瘤細(xì)胞P2的表達(dá)之間無(wú)明顯差異；對(duì)血管生成擬態(tài)密度與P2的表達(dá)做相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在親密相關(guān)，由此我們認(rèn)為P2

21、對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)起著重要作用，尤其對(duì)早期血管生成擬態(tài)的形成。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不支持P2與內(nèi)皮依賴(lài)性血管之間存在相關(guān)，但文獻(xiàn)報(bào)道P2是參與內(nèi)皮依賴(lài)性血管形成的重要分子。RihardEB等研究如今體外培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)區(qū)域P2、T1P、層粘連蛋白及其水解片段r2高表達(dá)，添加P的抑制劑可降低層粘連蛋白及其水解片段的程度，同時(shí)也有效阻斷了黑色素瘤細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)的這種才能1315。最近的研究進(jìn)一步證實(shí)層粘連蛋白及其水解片段可以與細(xì)胞外表的整合素受體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞的增殖和遷移具有重要作用。這提示我們黑色素瘤的血管生成擬態(tài)的形成不僅需要蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的降

22、解產(chǎn)物在該過(guò)程中的作用同樣不可缺少。當(dāng)將人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于基底膜樣物質(zhì)上時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞很快排列成直線，圍成管狀，編織成血管網(wǎng)，用明膠酶譜分析顯示培養(yǎng)液上清液中含有大量活化的P2和P9；人工添加兩種酶的抗體可降低甚至完全阻遏基質(zhì)中內(nèi)皮細(xì)胞管狀構(gòu)造的形成；P2的活性顯然是軟骨肉瘤形成模型中向血管生成表型轉(zhuǎn)化所必須的。血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞P9表達(dá)較高，遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞低表達(dá)，內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞高表達(dá)，遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的腫瘤細(xì)胞P9的表達(dá)較低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞P9的表達(dá)高于內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)哪[瘤細(xì)胞的表達(dá)，血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞的表達(dá)與遠(yuǎn)離血管

23、生成擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞的表達(dá)之間無(wú)差異，內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)哪[瘤細(xì)胞的表達(dá)與遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的腫瘤細(xì)胞表達(dá)之間無(wú)差異，說(shuō)明血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞的P9的表達(dá)對(duì)血管生成擬態(tài)的形成有所奉獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果不支持我們的結(jié)論，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道P9參與血管生成擬態(tài)的形成，因此需要今后進(jìn)一步討論兩者的關(guān)系。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P9在內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)谋磉_(dá)在血管生成擬態(tài)形成的第5天出現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明P9在內(nèi)皮依賴(lài)性血管的形成中發(fā)揮作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不支持P9的表達(dá)與內(nèi)皮依賴(lài)性血管的相關(guān)，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)均支持P9對(duì)內(nèi)皮依賴(lài)性血管的奉獻(xiàn)。有人在研究鼻咽癌時(shí)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞在分化過(guò)程中，它可誘導(dǎo)周?chē)g質(zhì)的成纖維細(xì)胞、浸潤(rùn)的單核細(xì)

24、胞同時(shí)表達(dá)P9，特別是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的P9，在腫瘤微環(huán)境內(nèi)可有效地影響腫瘤細(xì)胞的血管化、生長(zhǎng)速度、基質(zhì)的形成及基質(zhì)的降解。Deniser等在胰腺癌的轉(zhuǎn)基因鼠模型中發(fā)現(xiàn)P9是血管形成開(kāi)關(guān)機(jī)制的扳機(jī)點(diǎn)16，17。Nastris等認(rèn)為由于基質(zhì)分子的降解，使得原來(lái)被隔離在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的生長(zhǎng)因子VEGF、BFGF、IGF1得以釋放和激活腫瘤通過(guò)產(chǎn)生大量的P2、P9而加速新生血管生成18、19。內(nèi)皮細(xì)胞在根底狀態(tài)下表達(dá)一定程度的Ps，在受到刺激或處于某種特定狀態(tài)下其表達(dá)譜或表達(dá)量有所改變，體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞一旦形成卵石樣單層，即表達(dá)合成P1、P2、P3、P9和TP，一般情況下有兩種以上的Ps共同表達(dá)，作

25、用為相加或互相激活；不同組織的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)各種刺激的反響不同，說(shuō)明在體內(nèi)Ps的程度受到準(zhǔn)確調(diào)節(jié)，以維持細(xì)胞和組織的完好性。以上的研究都支持P2和P9參與了內(nèi)皮依賴(lài)性血管的形成，并在其中發(fā)揮主要作用，而我們的實(shí)驗(yàn)未得出同樣結(jié)論，可能與我們的樣本量小，實(shí)驗(yàn)周期偏短有一定關(guān)系。組織蛋白酶DathepsinDD是一種相對(duì)分子量為3.4104的天門(mén)冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶，廣泛存在于不同的組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，在酸性環(huán)境下降解細(xì)胞外蛋白質(zhì)，有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，與乳腺癌、膀胱癌等的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移親密相關(guān)，目前有關(guān)它在血管生成擬態(tài)中作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。我們對(duì)惡性黑色素移植瘤進(jìn)展D免疫組化染色，陽(yáng)性結(jié)果參照Dykins的標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜表達(dá)均為陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率77/11467%，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道根本一致；血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞表達(dá)高于遠(yuǎn)離擬態(tài)的腫瘤細(xì)胞，內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞的表達(dá)與遠(yuǎn)離內(nèi)皮依賴(lài)性血管的腫瘤細(xì)胞的表達(dá)之間無(wú)明顯差異，血管生成擬態(tài)周?chē)[瘤細(xì)胞的表達(dá)與內(nèi)皮依賴(lài)性血管周?chē)[瘤細(xì)胞表達(dá)之間無(wú)明顯差異，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示血管生成擬態(tài)周?chē)哪[瘤細(xì)胞的表達(dá)高于血管周?chē)哪[瘤細(xì)胞的表達(dá)，血管生成擬態(tài)周?chē)c遠(yuǎn)離血管生成擬態(tài)