蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇課件

1、 蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄翻譯基因表達(dá)系統(tǒng)DNA蛋白質(zhì)RNA逆轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)控中心法則基因表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄翻譯基因表達(dá)系統(tǒng)DNA蛋白質(zhì)RNA真核生物表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)原核生物表達(dá)系統(tǒng)其它基因表達(dá)系統(tǒng)酵母 植物昆蟲哺乳動物細(xì)胞. .無細(xì)胞系統(tǒng) 胚細(xì)胞. .原核表達(dá)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)原件原核生物表達(dá)系統(tǒng)原核生物受體細(xì)胞原核表達(dá)載體大腸桿菌芽孢桿菌鏈霉菌藍(lán)藻原核表達(dá)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)原件原核生物表達(dá)系統(tǒng)原核生物受體細(xì)胞原核表達(dá)載體大腸桿菌DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)原件大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)原核生物受體細(xì)胞原核表達(dá)載體選擇標(biāo)記復(fù)制子選擇標(biāo)記大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)復(fù)制子是一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)和反式因子作用

2、區(qū)的DNA片段。 大腸桿菌基因表達(dá)載體一般是質(zhì)粒表達(dá)載體，有效的復(fù)制子包含在質(zhì)粒中使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生新的表型，以便于將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞從大量的菌群中分離出來顯性標(biāo)記選擇標(biāo)記大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生新的表型，以便于將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞從大量的菌群中分離出來營養(yǎng)缺陷標(biāo)記氨芐青霉素抗性四環(huán)素抗性鏈霉素抗性氯霉素抗性卡那霉素抗性在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可使抑制物失活，啟動子功能重新恢復(fù)。是一段能被宿主RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列 抑制基因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)啟動子種類: 誘導(dǎo)型啟動子,Lac、Trp、PR tra組成型啟動子,T7噬菌體的啟動子是一種控制啟動子功能的蛋白質(zhì)，對啟動子的起始轉(zhuǎn)錄功

3、能產(chǎn)生抑制作用防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，控制目的基因mRNA的長度，提高 mRNA穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上其它基因的異常表達(dá)使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后立即停止，避免多余的轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi)RNA的合成底物，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄量是一段終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA序列 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)終止子是原核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的一段DNA序列 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中表達(dá)真核基因或本身所含SD序列較弱的原核基因，必須從外部同時提供啟動子和有效的SD序列。SD序列大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)翻譯終止密碼子與核糖體相遇時，能使核糖體從mRNA模板上脫落下來，終止蛋白質(zhì)的翻譯過程 終止密碼子 起始密碼子是翻譯的起始位點(diǎn)，通常為AUG（編

4、碼met），是首選的起始密碼子。有極少數(shù)生物利用其它密碼子作為翻譯的起始密碼子，如GUG、UUG等起始密碼子劣勢 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異 源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定已發(fā)展為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列Thank you2013.01.08植物表達(dá)載體Ti質(zhì)粒表達(dá)載體Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒 為植物根癌土壤桿菌菌株中存在的質(zhì)粒，其特定部位與植物核內(nèi)DNA組合來表達(dá)

5、信息，使植物細(xì)胞腫瘤化。Ti質(zhì)粒是在根瘤土壤桿菌細(xì)胞中存在的一種染色體外自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中的一段DNA序列,可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中。這段DNA序列叫做T-DNA序列。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)Ti質(zhì)?？梢苑譃?個區(qū)：（1）T-DNA區(qū)（transfer DNA region,轉(zhuǎn)化DNA區(qū)）（2）Vir區(qū)（virulence region,致病區(qū)）（3）Ori區(qū)（orign of replication 質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)）（4）Con區(qū)（region encoding conjugations,結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)） 其中，T-D

6、NA可以整合到植物細(xì)胞染色體上。由于T-DNA上的基因帶有植物細(xì)胞可識別的表達(dá)調(diào)控信號，因此它能夠依賴植物細(xì)胞中的RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化過程T-DNA的邊界在T-DNA區(qū)的兩端有一個25bp的正向重復(fù)序列，這兩個片段是高度保守的。其中右邊界的序列是至關(guān)重要的。如果右邊界的序列發(fā)生突變，會使T-DNA的轉(zhuǎn)移功能徹底喪失或者是大大降低；但是如果突變左邊序列則影響比較小。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，只有T-DNA兩端的序列存在并且方向正確，那么在兩序列之間插入任何一個DNA片段都有可能被轉(zhuǎn)移整合到植物基因上去。在Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞時，Ti質(zhì)粒攜帶的外源DNA可達(dá)50kb以上。對T-DNA區(qū)改造的具

7、體方面切除致癌基因增加能插入外源DNA的單一限制酶切位點(diǎn)。插入選擇性標(biāo)記基因裝配高效啟動子和轉(zhuǎn)錄終止信號Ti載體系統(tǒng)（雙元載體系統(tǒng)）雙元載體是由兩個質(zhì)粒組成。一個是不含有T-DNA的Ti質(zhì)粒，提供Vir功能；另一個是具有廣宿主范圍的小質(zhì)粒，帶有T-DNA兩側(cè)末端重復(fù)序列以及選擇標(biāo)記基因、克隆位點(diǎn)等等。小質(zhì)粒重組了外源的DNA后，從大腸桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)農(nóng)桿菌，再去感染植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞的方法（1）葉圓片法：用打孔器打取幾毫米直徑的葉圓片，表面消毒，進(jìn)入農(nóng)桿菌液數(shù)秒后，置于適當(dāng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)到含有卡那霉素和羧芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天，通過脫分化、再分化長成新的含有目的基因的植株。

8、（2）整株感染：在無菌培養(yǎng)的整株植株的適當(dāng)部位上人工造成傷口，用農(nóng)桿菌液接種，待形成腫瘤后切下，在含有抗生素且無激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)并除菌。（3）原生質(zhì)體和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法：將除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后再分化細(xì)胞壁、脫分化、再分化得到含有目的基因的植物植株。 酵母表達(dá)系統(tǒng)Concept 酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)生 酵母表達(dá)系統(tǒng)的組成 主要酵母表達(dá)系統(tǒng) 不同酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 酵母表達(dá)系統(tǒng)的方法123451.酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)生 基因工程技術(shù)的發(fā)展為用微生物合成和生產(chǎn)外源蛋白展示出廣闊的前景。長期以來，人們用大腸桿菌作為宿主表達(dá)了多種蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)存在若干缺陷：A：缺少真核生物的蛋白

9、翻譯后修飾和加工B：表達(dá)的蛋白多以包含體形式存在，需要經(jīng)過復(fù) 雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性C：背景雜蛋白很多、純化起來麻煩D：表達(dá)量一般不是很高1979年，為了克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，發(fā)展了酵母表達(dá)系統(tǒng)。最先使用的是釀酒酵母。 1981年,Hizeman等人首次報道了人重組干擾素基因在釀酒酵母中表達(dá)并獲成功。酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：A.可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本B.收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達(dá)的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定C.很容易純化2.酵母表達(dá)系統(tǒng)的組成宿主質(zhì)粒載體自主復(fù)制型質(zhì)粒 選擇標(biāo)記外源基因表達(dá)的相關(guān)元件3.主要酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)乳酸克魯維亞

10、酵母表達(dá)系統(tǒng) 甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)3.1甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇作為唯一的能源和碳源 表達(dá)載體：整合體型載體篩選標(biāo)記：組氨醇脫氫酶 基因HIS4啟動子：AOX1作為分泌型表達(dá)時，外 源基因需要接上一段信號 肽序列我國酵母表達(dá)載體產(chǎn)品結(jié)構(gòu)分析畢赤酵母系統(tǒng)模式表達(dá)載體5AOX1 啟動子片段含有AOX1啟動子，在甲醇的誘導(dǎo)下可啟動外源蛋白的表達(dá);-因子信號肽序列為約89個氨基酸的信號肽序列，能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中，更利于外源蛋白的純化；多克隆位點(diǎn)含多個酶切位點(diǎn)，為外源基因的插入提供位點(diǎn)；TT序列提供有效的轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號； HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)志；3AOX

11、1 基因片段能夠與基因組AOX1基因同源重組；抗Amp基因和pBR322復(fù)制起始位點(diǎn)，使載體可在E.coli中篩選和復(fù)制。外源蛋白在酵母菌中表達(dá)的一般步驟:（1）將編碼外源蛋白的DNA序列克隆到含有酵母啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子的表達(dá)框中；（2）轉(zhuǎn)化及在宿主中穩(wěn)定維持該DNA融合產(chǎn)物；（3）外源蛋白在特定培養(yǎng)條件下合成；（4）外源蛋白的純化與及其天然產(chǎn)物的比較。3.2 高效表達(dá)特性高效產(chǎn)生的關(guān)鍵因素表達(dá)載體受體菌：蛋白水解酶缺陷型整合型表達(dá)載體甲醇氧化酶啟動子pAOX1 醇氧化酶-1（AOX1）的終止子3AOX1 釀酒酵母的分泌信號和前導(dǎo)肽序列甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)： A.應(yīng)用AOX啟動子，

12、轉(zhuǎn)錄效率高，易于誘發(fā)調(diào)控B.表達(dá)質(zhì)粒易于整合到基因組,不易丟失,適于高度 發(fā)酵,產(chǎn)量高C.表達(dá)產(chǎn)物分揀進(jìn)入過氧化物酶體,利于工業(yè)生產(chǎn)和分離純化D.對分泌蛋白的糖基化修飾和糖基化程度適中甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)的主要不足：A.甲醇不適于食品工業(yè)生產(chǎn)B.易發(fā)生火災(zāi)ThankYou!昆蟲表達(dá)系統(tǒng)Insect Expression昆蟲表達(dá)系統(tǒng)用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞系中表達(dá)外源蛋白目前應(yīng)用較多，對果蠅等昆蟲進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后可以獲得穩(wěn)定性和表達(dá)效率方面更為優(yōu)異的表達(dá)系統(tǒng)。目前已經(jīng)利用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了鼠源單克隆抗體、人一鼠嵌合抗體、單鏈抗體、人單克隆抗體及抗體融合蛋白等基因工程抗體分子，這些抗體分子多

13、數(shù)能正確組裝，完成糖基化過程，具有相當(dāng)?shù)幕钚浴?(一)以重組桿狀病毒為載體的昆蟲表達(dá)體系多數(shù)桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建過程大體如下：將目的基因克隆入合適的轉(zhuǎn)移載體用重組的轉(zhuǎn)移載體和相應(yīng)的野生性或改造過的野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞用噬菌斑分析分離并鑒定陽性重組體 擴(kuò)增病毒以進(jìn)行大規(guī)模的蛋白生產(chǎn)純化所表達(dá)的外源蛋白 多核多角體病毒(MNPv)是應(yīng)用最廣的桿狀病毒載體該病毒基因組為共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA，長80200kb，1，組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配 2，具有與高等生物相似的蛋白翻譯后的加工修飾能力3，表達(dá)水平高，可達(dá)總蛋白量的50%； 4，可容納大分子的插入片

14、段； 5，能同時表達(dá)多個基因。外源蛋白的表達(dá)的影響因素高質(zhì)量的培養(yǎng)基是獲得高效表達(dá)的前提，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)要求相對較高的氧濃度，應(yīng)使細(xì)胞具有高度活性并維持在對數(shù)增長期。除此之外，使用的載體、啟動子、前導(dǎo)肽以及所表達(dá)外源基因的特性也會對表達(dá)水平產(chǎn)生影響。（二）穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)用適當(dāng)啟動子驅(qū)動外源基因?qū)ハx進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞通常來源于雙翅目昆蟲，包括來自果蠅的Schneider2和Kc以及來自白紋伊蚊(Aedeslbopictus)的C7等細(xì)胞系。對其它屬的昆蟲，特別是桿狀病毒載體常用的鱗翅目昆蟲的轉(zhuǎn)化報道極少。將嵌合的蠶絲蛋白輕鏈一綠色熒光蛋白基因序列裝入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體后完成了對家蠶的轉(zhuǎn)化并定位于基因組的蠶絲