毒理學(xué)基礎(chǔ)：第七章 外源化學(xué)物致突變作用

1、第 七 章外源化學(xué)物致突變作用第一節(jié) 概述第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型第三節(jié) 外源化學(xué)物致突變作用的機(jī)制及后果第四節(jié) 機(jī)體對致突變作用的影響第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法一、概 述1927年 Muller發(fā)現(xiàn)電離輻射可引起基因突變1947年 Auebach發(fā)現(xiàn)某些化學(xué)物也可導(dǎo)致突變1960年 致突變化學(xué)物可能具有嚴(yán)重的全球性的環(huán) 境威脅1969年 國際環(huán)境誘變劑學(xué)會成立1970年 遺傳毒理學(xué)-毒理學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要分支1927用X射線照射發(fā)現(xiàn)可以引起基因突變1946年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)生理學(xué)獎(jiǎng)美國著名的遺傳學(xué)家、輻射遺傳學(xué)創(chuàng)始人Muller一、概 述突變（mutation）：遺傳物質(zhì)

2、本身發(fā)生的可遺傳的變異。 自發(fā)突變（spontaneous mutation） 誘發(fā)突變（induced mutation）一、概 述突變致突變性（mutagenicity）：化學(xué)物質(zhì)或其他環(huán)境因素引起遺傳物質(zhì)發(fā)生突變的能力。致突變作用（mutagenesis）：化學(xué)物質(zhì)或其他環(huán)境因素引起生物體遺傳物質(zhì)的突變效應(yīng)?；瘜W(xué)致突變劑（chemical mutagen） 直接致突變劑（direct-acting mutagen） 間接致突變劑（indirect-acting mutagen）一、概 述遺傳毒性 vs 致突變性致突變性是精確的概念，突變率可定量檢測。遺傳毒性泛指對基因組的毒性，既包括致突

3、變性，也包括其他效應(yīng)，如非程序外DNA合成、姐妹染色單體交換及染色體斷裂等。一、概 述DNA & 基因 DNA由脫氧核糖、磷酸及堿基組成，基本成分為四種核苷酸，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 基因是DNA分子中最小的完整功能單位 。二、遺傳學(xué)基礎(chǔ)2. 染色質(zhì) & 染色體 間期細(xì)胞的細(xì)胞核中，可見一種能被堿性染料著色的物質(zhì)，即染色質(zhì)。它由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量的RNA組成，形似串珠狀的復(fù)合體。 在細(xì)胞分列時(shí)，染色質(zhì)才螺旋化并折疊成染色體。二、遺傳學(xué)基礎(chǔ)3. 體細(xì)胞 & 生殖細(xì)胞體細(xì)胞（somatic cell）多是二倍體（diploid）細(xì)胞，含有兩組完全相同的染色體，其遺傳損傷不會遺傳給下一代。生殖

4、細(xì)胞（germ cell）往往是單倍體，其染色體改變可傳給下一代。二、遺傳學(xué)基礎(chǔ)4. 細(xì)胞周期 細(xì)胞一次分裂結(jié)束，并開始生長，到下一次分裂終了所經(jīng)歷的過程。 G1 ：DNA合成前期 S： 完成DNA復(fù)制 G2：為有絲分裂做準(zhǔn)備 M：有絲分裂期 二、遺傳學(xué)基礎(chǔ)5. 有絲分裂 & 減數(shù)分裂二、遺傳學(xué)基礎(chǔ)第一節(jié) 概述第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型第三節(jié) 外源化學(xué)物致突變作用的機(jī)制及后果第四節(jié) 機(jī)體對致突變作用的影響第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型 一、 基因突變二、 染色體畸變?nèi)?非整倍體和多倍體一、基因突變基因突變（gene mutation）：指基因中D

5、NA序列的變化。分類： 堿基置換（base substitution） 移碼突變（frameshift mutation） 密碼子插入或缺失（一）堿基置換類型： 轉(zhuǎn)換（transition） 顛換（transversion）結(jié)果：導(dǎo)致一個(gè)三聯(lián)體密碼子的改變。 同義突變 錯(cuò)義突變 無義突變 終止密碼突變 一、基因突變一、基因突變錯(cuò)義突變實(shí)例：人類鐮刀型貧血病的形成 鐮刀型貧血病是一種遺傳疾病。其特點(diǎn)是病人的血紅蛋白亞基N端的第六個(gè)氨基酸殘基是纈氨酸（vol），而不是下正常的谷氨酸殘基(Glu)。（二）移碼突變 指發(fā)生一對或幾對（3對除外）的堿基減少或增加，以致從受損點(diǎn)開始堿基序列完全改變，形成錯(cuò)

6、誤的密碼，并轉(zhuǎn)譯成為不正常的氨基酸。一、基因突變增添缺失（三）密碼子插入或缺失 DNA序列中插入或缺失的堿基數(shù)恰好為一個(gè)或多個(gè)三聯(lián)體，指導(dǎo)合成的多肽鏈增加或減少一個(gè)或多核氨基酸，此部位之后的氨基酸序列無改變。 舉例：異常血紅蛋白Hb GunHi11是mRNA鏈92-97 位間5個(gè)密碼子缺失，而造成相應(yīng)的5個(gè)氨基 酸缺失。一、基因突變第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型 一、 基因突變二、 染色體畸變?nèi)?非整倍體和多倍體堿基置換移碼突變密碼子插入或缺失二、染色體畸變?nèi)旧w畸變（chromosome aberration）：指染色體的結(jié)構(gòu)改變，它是指遺傳物質(zhì)大的改變，一般可用光學(xué)顯微鏡檢查適當(dāng)細(xì)胞有絲

7、分裂中期的染色體來發(fā)現(xiàn)。 染色單體型畸變（chromatid-type aberration） 染色體型畸變（chromosome-type aberration）染色體結(jié)構(gòu)異常的類型:1）缺失（deletion）：染色體上丟失了一個(gè)片段。2）重復(fù)（duplication）：在一套染色體里,一個(gè)染色 體片段出現(xiàn)不止一次。二、染色體畸變3）倒位（inversion）：一個(gè)染色體片段被顛倒了，如顛倒的片段包括著絲點(diǎn)，稱為臂間倒位；如不包括著絲點(diǎn)則稱為臂內(nèi)倒位。二、染色體畸變4）易位（transloca-tion）：一個(gè)染色體片段的位置改變了。最常見的是相互易位，涉及兩個(gè)非同源染色體片段交換。 二、

8、染色體畸變5）無著絲點(diǎn)環(huán)：染色體長臂發(fā)生兩次斷裂后兩斷端重接而成。6）著絲點(diǎn)環(huán)：染色體兩臂遠(yuǎn)端各發(fā)生一次斷裂，帶著絲點(diǎn)節(jié)段的兩斷端重接而成。7）裂隙或斷裂8）雙著絲點(diǎn)和多著絲點(diǎn)畸變二、染色體畸變?nèi)旧w斷裂缺失舉例：貓叫綜合征二、染色體畸變 貓叫綜合征，患者第5號染色體短臂缺失，是最常見的缺失綜合征。因嬰兒時(shí)有貓叫樣啼哭而得名，其原因在于患兒的喉部發(fā)育不良或未分化所致。第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型 一、 基因突變二、 染色體畸變?nèi)?非整倍體和多倍體缺 失重 復(fù)倒 位易 位無著絲點(diǎn)環(huán)著絲點(diǎn)環(huán)斷裂/裂隙雙著絲粒或多著絲?；?nèi)?、非整倍體和多倍體 非整倍體（aneuploidy）和多倍體（poly

9、ploidy）的細(xì)胞的染色體數(shù)目不同于正常的細(xì)胞染色體數(shù)目，或稱為基因組突變，即基因組中染色體數(shù)目的改變。非整倍體：指增加或減少一條或幾條染色體。 如21三體綜合征（Down氏）多倍體：指以染色體組為單位的增加。 如人有69條染色體，此為三倍體。非整倍體舉例：21三體綜合征（先天愚型）三、非整倍體和多倍體21三體綜合征（又稱先天愚型或唐氏綜合征）患者的智力低下，身體發(fā)育緩慢, 患兒常表現(xiàn)出特殊的面容。非整倍體舉例：18三體綜合征三、非整倍體和多倍體18三體綜合癥是次于先天愚型的第二種常見染色體三體征。主要臨床表現(xiàn)為多發(fā)畸形，多于生后數(shù)周死亡。多倍體舉例：三倍體嬰兒三、非整倍體和多倍體A tri

10、ploid infant, showing the characteristic enlarged head.第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型 一、 基因突變二、 染色體畸變?nèi)?非整倍體和多倍體堿基取代移碼突變密碼子插入或缺失缺 失重 復(fù)倒 位易 位無著絲點(diǎn)環(huán)著絲點(diǎn)環(huán)斷裂/裂隙雙著絲?；蚨嘀z粒畸變第一節(jié) 概述第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型第三節(jié) 外源化學(xué)物致突變作用的機(jī)制及后果第四節(jié) 機(jī)體對致突變作用的影響第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法第三節(jié) 致突變作用的機(jī)制及其后果一、引起突變的DNA變化二、引起突變的細(xì)胞分裂過程的改變?nèi)?、其他改變四、突變后果以DNA為靶的直接誘變不以DNA為

11、靶的間接誘變一、引起突變的DNA變化（一）堿基損傷（二）DNA鏈?zhǔn)軗p堿基錯(cuò)配平面大分子嵌入DNA鏈堿基類似物取代堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞二聚體的形成DNA加合物形成DNA-蛋白交聯(lián)物形成（一）堿基損傷堿基錯(cuò)配 烷化劑所致DNA鏈上的堿基發(fā)生烷化變現(xiàn)為錯(cuò)配。 烷化劑：一類具有一個(gè)或多個(gè)活性烷基的化合物。 芥子氣、甲基磺酸乙酯（EMS）、 硫酸二乙酯 （DES）、乙烯亞胺（EI）、亞硝基胍等。烷化劑（alkylating agent）是對DNA和蛋白質(zhì)都有強(qiáng)烈烷化作用的物質(zhì)。烷化作用指烷化劑提供甲基或乙基等烷基與DNA共價(jià)結(jié)合的過程。（一）堿基損傷（2）脫嘌呤作用：G烷化后從DNA上脫掉 ，留下缺

12、口，影 響DNA的復(fù)制或使核苷酸順序縮短，引 起轉(zhuǎn)換、顛換或移碼突變。（1）添加甲基或乙基：給鳥嘌呤（G）使G與T配對。引起突變的途徑：烷化劑舉例：鳥嘌呤上添加甲基或乙基（一）堿基損傷2. 平面大分子嵌入DNA鏈能夠非共價(jià)結(jié)合到DNA分子中，引起DNA分子中遺傳密碼的閱讀順序發(fā)生改變，從而導(dǎo)致突變。 吖啶類（如原黃素、吖黃素、吖啶黃）分子扁平，能插入DNA相鄰堿基對間，使DNA分子雙鏈歪斜，導(dǎo)致不等交換，產(chǎn)生的兩個(gè)重組分子，一個(gè)堿基對增多，一個(gè)堿基對減少。 吖啶類化合物氮芥類（ICR）化合物增加（+）或減少（-）一個(gè)或幾個(gè)堿基對 移碼突變（一）堿基損傷（一）堿基損傷平面大分子嵌入DNA鏈舉例3

13、. 堿基類似物取代（一）堿基損傷堿基類似物：分子結(jié)構(gòu)與天然4種堿基結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)。常見的堿基類似物有 5-溴尿嘧啶（BU）和 2-氨基嘌呤（AP）舉例：5-溴尿嘧啶（BU）引起的堿基替換。正常情況：A=T，酮式BU=A，烯醇式BUG（少見），當(dāng)BU參與DNA復(fù)制時(shí)，BU在酮式與烯醇式之間轉(zhuǎn)換，結(jié)果A=T 轉(zhuǎn)換成GC 。2-氨基嘌呤舉例：2-氨基嘌呤（AP）引起的堿基替換正常情況：AP是腺嘌呤A的類似物，可與T發(fā)生配對，轉(zhuǎn)換為2-亞氨基嘌呤后又可以與C配對，結(jié)果將A=T 轉(zhuǎn)換成GC 。4. 堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞 有些化學(xué)物可對堿基產(chǎn)生氧化作用，從而破壞或改變堿基的結(jié)構(gòu)，甚至引起DNA鏈的斷裂

14、。舉例：亞硝胺（HNO2）（一）堿基損傷移碼突變氧化脫氨基作用AH、CU（一）堿基損傷 A HC C U A4. 堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞 舉例：羥胺（HA） HA是一種還原劑，可將胞嘧啶（C）上的氨基變?yōu)榱u氨基，使C與A配對，從而使GC對轉(zhuǎn)換為AT對。（一）堿基損傷 C A GCA=T一、引起突變的DNA變化（一）堿基損傷（二）DNA鏈?zhǔn)軗p堿基錯(cuò)配平面大分子嵌入DNA鏈堿基類似物取代堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞二聚體的形成DNA加合物形成DNA-蛋白交聯(lián)物形成一、引起突變的DNA變化（一）堿基損傷（二）DNA鏈?zhǔn)軗p堿基錯(cuò)配平面大分子嵌入DNA鏈堿基類似物取代堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞二聚體的形成D

15、NA加合物形成DNA-蛋白交聯(lián)物形成（二）DNA鏈?zhǔn)軗p二聚體形成 細(xì)胞或機(jī)體受紫外線照射后，可引起DNA結(jié)構(gòu)損傷，主要表現(xiàn)為嘧啶二聚體的形成。2. DNA加合物形成活性化學(xué)物能夠與DNA發(fā)生共價(jià)結(jié)合形成的穩(wěn)定復(fù)合物，一般的化學(xué)或生物學(xué)方法很難使其解離。DNA加合物可活化癌基因，影響調(diào)節(jié)原癌基因和抑癌基因的表達(dá)。（二）DNA鏈?zhǔn)軗pDNA蛋白交聯(lián)物形成成因：DNA與核蛋白之間發(fā)生共價(jià)鍵結(jié)合。后果：影響DNA構(gòu)象及后續(xù)的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄。相關(guān)物質(zhì)：苯并芘、砷化合物、醛類化合物、輻射等。 （二）DNA鏈?zhǔn)軗p一、引起突變的DNA變化（一）堿基損傷（二）DNA鏈?zhǔn)軗p堿基錯(cuò)配平面大分子嵌入DNA鏈堿基類似物取代堿

16、基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞二聚體的形成DNA加合物形成DNA-蛋白交聯(lián)物形成一、引起突變的DNA變化（一）堿基損傷（二）DNA鏈?zhǔn)軗p堿基錯(cuò)配平面大分子嵌入DNA鏈堿基類似物取代堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變或破壞二聚體的形成DNA加合物形成DNA-蛋白交聯(lián)物形成第三節(jié) 致突變作用的機(jī)制及其后果一、引起突變的DNA變化二、引起突變的細(xì)胞分裂過程的改變?nèi)?、其他改變四、突變后果二、引起突變的?xì)胞分裂過程改變非整倍體和多倍體的產(chǎn)生與其他致突變作用有所不同，是由染色體分離異常而產(chǎn)生的。在有絲分裂過程中，某些化學(xué)物可干擾紡錘體的形成，如完全阻止即形成多倍體，如部分阻止則形成非整倍體。二、引起突變的細(xì)胞分裂過程改變紡錘體形

17、成抑制或功能障礙1.與微管蛋白二聚體結(jié)合：妨礙微管的正確組裝，引起細(xì)胞分裂完全抑制，如秋水仙堿、長春堿等。2.與微管上的巰基結(jié)合：使細(xì)胞分裂部分抑制，形成非整倍體，如鉛、汞、砷等。二、引起突變的細(xì)胞分裂過程改變破壞已組裝好的微管：灰黃霉素破壞微管聚合-解聚的動(dòng)態(tài)平衡，秋水仙堿直接使微管解體，毛地黃皂苷通過蛋白質(zhì)變性作用破壞微管。妨礙中心粒移動(dòng)：秋水仙堿妨礙有絲分裂早期兩對中心粒的分離和移向兩極。其他作用第三節(jié) 致突變作用的機(jī)制及其后果一、引起突變的DNA變化二、引起突變的細(xì)胞分裂過程的改變?nèi)?、其他改變四、突變后果三、其他的改?對DNA合成和修復(fù)有關(guān)酶系統(tǒng)的作用可間接損傷DNA，誘發(fā)基因突變或

18、染色體畸變。DNA高保真復(fù)制需多種酶類參與，并在基因調(diào)控下進(jìn)行，任何環(huán)境損傷，將可能引起突變。DNA修復(fù)過程是清除受損傷的DNA片段，這一過程同樣依賴各種酶的參與，修復(fù)障礙可導(dǎo)致突變。第三節(jié) 致突變作用的機(jī)制及其后果一、引起突變的DNA變化二、引起突變的細(xì)胞分裂過程的改變?nèi)?、其他改變四、突變后果四、突變后果第一?jié) 概述第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型第三節(jié) 外源化學(xué)物致突變作用的機(jī)制及后果第四節(jié) 機(jī)體對致突變作用的影響第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法第四節(jié) 機(jī)體對突變作用的影響一、DNA損傷的修復(fù)二、遺傳因素對致突變作用的影響一、DNA損傷的修復(fù)（一）直接修復(fù)（二）堿基切除修復(fù)（三）核

19、苷酸切除修復(fù)（四）雙鏈斷裂修復(fù)（五）交聯(lián)修復(fù)（一）直接修復(fù)1. 光復(fù)活A(yù).形成嘧啶二聚體B.光復(fù)合酶結(jié)合于損傷部位C.酶被可見光激活D.修復(fù)后酶被釋放DNA紫外線損傷的光復(fù)合酶修復(fù)2. “適應(yīng)性”反應(yīng)（一）直接修復(fù)（二）堿基切除修復(fù) DNA 糖基酶修復(fù)：糖基酶可識別異常的堿基，通過切斷堿基與脫氧核糖連接的鍵，使受損的堿基脫落，產(chǎn)生無堿基（AP）位點(diǎn)，再由AP內(nèi)切酶修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)。 AP內(nèi)切酶修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)：由內(nèi)切酶、外切酶、聚合酶和連接酶活性來完成，以修復(fù)AP位點(diǎn)。（三）核苷酸切除修復(fù)在DNA內(nèi)切酶、DNA聚合酶、外切酶、DNA連接酶等共同作用下，將DNA受損部位部分切除，并以其中一條鏈為模板，合

20、成修復(fù)。 消除由UV引起的損傷，也能消除由電離輻射和化學(xué)誘變劑引起的其他損傷。切除的片段可由幾十到上萬 bp，分別稱短補(bǔ)丁修復(fù)、長補(bǔ)丁修復(fù)。堿基切除 核苷酸切除（四）雙鏈斷裂修復(fù)DNA雙鏈斷裂嚴(yán)重威脅細(xì)胞存活。未修復(fù)的雙鏈斷裂可以啟動(dòng)DNA損傷反應(yīng)系統(tǒng)，使細(xì)胞阻滯于周期的某一期或誘發(fā)細(xì)胞凋亡。雙鏈斷裂可以通過同源重組或者非同源末端連接機(jī)制被修復(fù)。（五）交聯(lián)修復(fù) 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生DNA鏈內(nèi)交聯(lián)，會造成雙鏈的斷裂，機(jī)體啟動(dòng)兩種修復(fù)：無誤交聯(lián)修復(fù)：降解雙螺旋，使鏈內(nèi)交聯(lián)轉(zhuǎn)變?yōu)殒渻?nèi)二核苷酸加合物接連于雙鏈斷裂處，隨后Holiday連接體分解，核苷酸切除修復(fù)最終去除二核苷酸交聯(lián)；易誤交聯(lián)修復(fù)：包括整個(gè)核苷酸

21、切除修復(fù)和易誤DNA聚合酶。二、遺傳因素對致突變作用的影響（一）代謝酶遺傳多態(tài)性 1. 氧化代謝酶 2. 酯酶 3. 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）（二）修復(fù)功能的個(gè)體差異 1. O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT） 2. 聚（二磷酸腺苷-核糖）多聚酶（PARP） 第一節(jié) 概述第二節(jié) 外源化學(xué)物致突變的類型第三節(jié) 外源化學(xué)物致突變作用的機(jī)制及后果第四節(jié) 機(jī)體對致突變作用的影響第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法一、觀察項(xiàng)目的選擇二、常用的致突變試驗(yàn)三、致突變試驗(yàn)中的一些問題一、觀察項(xiàng)目的選擇（一）遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹峦蛔冃缘谋O(jiān)督預(yù)測潛在致

22、癌物以及各種遺傳毒物的監(jiān)測及評價(jià)（二）觀察的效應(yīng)終點(diǎn)類型基因突變?nèi)旧w畸變?nèi)旧w組畸變DNA原始損傷（三）成套的觀察項(xiàng)目入選原則：一組可靠的試驗(yàn)系統(tǒng)應(yīng)包括每一類型的遺傳學(xué)終點(diǎn)。配套實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括多種進(jìn)化程度不同的物種。通常的實(shí)驗(yàn)材料有病毒、細(xì)菌、真菌、培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物、昆蟲及哺乳動(dòng)物等。體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)配合。一、觀察項(xiàng)目的選擇第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法一、觀察項(xiàng)目的選擇二、常用的致突變試驗(yàn)三、致突變試驗(yàn)中的一些問題（一） 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）（二）微核試驗(yàn)（三）染色體畸變分析（四）姐妹染色單體交換試驗(yàn)（五）果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)（六）顯性致死試驗(yàn)（七）程序外DN

23、A合成試驗(yàn)（八）單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（九）觀察方法的新進(jìn)展二、常用的致突變試驗(yàn)（一）細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)：利用突變體的測試菌株，觀察受試物能否糾正或補(bǔ)償突變體所攜帶的突變改變，判斷其致突變性。常用的菌株有組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和色氨酸營養(yǎng)缺陷型的大腸埃希菌。鼠傷寒沙門菌突變試驗(yàn)是應(yīng)用最為廣泛的檢測基因突變的方法，又稱Ames試驗(yàn)。（一）細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) Ames試驗(yàn)原理：鼠傷寒沙門菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株在組氨酸操縱子中有一個(gè)突變，突變的菌株必須依賴外源性的組氨酸才能夠生長。致突變物可以誘導(dǎo)突變的菌株發(fā)生回復(fù)突變，恢復(fù)組氨酸合成的能力，在不含組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長成可見的

24、菌落。計(jì)數(shù)誘發(fā)的回復(fù)菌落數(shù)即可判定化學(xué)毒物的致突變性。Ames試驗(yàn)原理示意圖正向突變野生型細(xì)菌（原養(yǎng)型） 突變型細(xì)菌（組氨酸缺陷型） 回復(fù)突變（一）細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（一）細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（一）細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)（二）微核試驗(yàn)經(jīng)致突變物作用后，染色體無著絲點(diǎn)斷片或因紡錘體受損傷而丟失的整個(gè)染色體在細(xì)胞分裂的后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，成為一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，稱為微核。微核試驗(yàn)是以微核發(fā)生率或有微核的細(xì)胞率為觀察指標(biāo)來檢測化學(xué)物染色體損害能力的試驗(yàn)，主要用于檢測DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。常用嚙齒類動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE）微核試驗(yàn)。PCE是紅細(xì)胞成熟的一個(gè)階段，此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出，微核容

25、易辯認(rèn)。 （二）微核試驗(yàn)（二）微核試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、不需特殊試劑及設(shè)備，不要求有良好的核型，自發(fā)率低，種間差異小，試驗(yàn)周期短，可供分析的細(xì)胞數(shù)量和種類不受限制，在整個(gè)間期均可觀察微核，簡便快速，容易掌握。缺點(diǎn)：能檢測的畸變類型較少；有些化合物在骨髓中，難以達(dá)到有效濃度；骨髓中PCE是動(dòng)態(tài)平衡，PCE 可不斷成熟為紅細(xì)胞，紅細(xì)胞又衰老死亡；化學(xué)毒物主要在肝臟活化，其活化中間產(chǎn)物可能在到達(dá)骨髓之前消失；僅觀察體細(xì)胞，其結(jié)果外推至其他組織應(yīng)慎重。（二）微核試驗(yàn)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)：1. 體外微核實(shí)驗(yàn)：中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL）、中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）及中國倉鼠成纖維細(xì)胞（V79）等。2. 周圍血微核實(shí)驗(yàn)：

26、使其有可能成為人群中觀察化學(xué)物遺傳毒性的一種手段。3. 雙核細(xì)胞法：可以提高微核的靈敏度。4. 免疫熒光染色法和熒光原位雜交：提高靈敏度、判斷微核來源。（二）微核試驗(yàn)（三）染色體畸變分析觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變稱為染色體畸變分析（chromosome aberration analysis），又稱細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)（cytogenetic assay）。（三）染色體畸變分析（三）染色體畸變分析將人類24種染色體顯示出的各自特異的帶紋。Q帶：氮芥喹吖因（QM）G帶：胰酶GiemsaR帶：經(jīng)鹽處理的標(biāo)本Giemsa 反帶，研究末端缺失和結(jié) 構(gòu)重排。C帶：NaOH Giemsa -著絲粒和副縊痕。N

27、帶：硝酸銀染色體顯帶技術(shù)（三）染色體畸變分析（三）染色體畸變分析姐妹染色單體交換（SCE）是染色體同源座位上DNA復(fù)制產(chǎn)物的相互交換，SCE可能與DNA的斷裂和重接有關(guān)，提示DNA損傷。許多致突變物可誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞和整體哺乳動(dòng)物的SCE。盡管此方法方便、有效，但由于不能肯定SCE的形成機(jī)制是否涉及DNA損傷或DNA合成的紊亂，因此結(jié)果的可信度稍差。（四）姐妹染色單體交換試驗(yàn)原理：對于分裂的細(xì)胞，如將5溴脫氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）加入合成DNA的原料中，經(jīng)過兩個(gè)分裂周期后，兩條染色單體，其中一條DNA鏈的雙股內(nèi)的胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一條只有一股被取代。用染色劑處理，使雙股含BrdU

28、的染色單體著色淺淡，單股含BrdU的染色單體著色深。（四）姐妹染色單體交換試驗(yàn)（四）姐妹染色單體交換試驗(yàn) 果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)（Sex-linked recessive lethal test，SLRL）是利用隱性基因在伴性遺傳中具有交叉遺傳特征。選擇黑腹果蠅作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雄蠅的X染色體的突變傳給F1代雌蠅，又通過F1代傳給F2代雄蠅。位于X染色體上的隱性基因能在半合子雄蠅中表現(xiàn)出來，據(jù)此推斷致死突變的存在。（五）果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)（五）果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)（六）顯性致死試驗(yàn)顯性致死試驗(yàn)是一種體內(nèi)試驗(yàn)，用于檢測整體哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞遺傳性損傷。 顯性致死突變指哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)和數(shù)

29、目變化，出現(xiàn)的受精卵在著床前死亡或胚胎早期死亡。實(shí)驗(yàn)對雄性動(dòng)物染毒，觀察一個(gè)精子發(fā)育周期中各階段雌鼠胚胎早期死亡發(fā)生率的變化，進(jìn)而判斷受試物對雄性生殖系統(tǒng)的損傷。（六）顯性致死試驗(yàn)（七）程序外DNA合成試驗(yàn) 程序性DNA合成 程序外DNA合成 當(dāng)DNA受損時(shí)，發(fā)生于S期半保留復(fù)制之外的DNA合成。（八）單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn) 單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel electro-phoresis，SCGE）也稱彗星試驗(yàn)（comet assay），原理是在DNA損傷時(shí)，斷裂的DNA片段比大片段DNA遷移的更快，電泳后出現(xiàn)慧星狀，即可判斷DNA損傷。SCGE在檢測低水平的DNA損傷時(shí)具有較高

30、的敏感性。（八）單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（九）觀察方法的新進(jìn)展 轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測系統(tǒng) 微核自動(dòng)化檢測技術(shù) 熒光原位雜交技術(shù) （Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH） 原位熒光雜交技術(shù)（FISH）原理：使用同熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探針與變性后的染色體、細(xì)胞或組織中的核酸按照堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交，經(jīng)變性退火復(fù)性洗滌后即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體，通過免疫熒光系統(tǒng)在熒光顯微鏡下顯影，即可對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。 FISH技術(shù)： 顯示染色體的局部或整體。單一位點(diǎn)探針端粒探針多色-FISH第五節(jié) 觀察外源化學(xué)物致突變作用的基本方法一、觀

31、察項(xiàng)目的選擇二、常用的致突變試驗(yàn)三、致突變試驗(yàn)中的一些問題三、致突變實(shí)驗(yàn)中的一些問題（一）陰性和陽性對照的設(shè)立 通過對照還可消除或減少實(shí)驗(yàn)誤差，在遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中均應(yīng)設(shè)立陰性對照和陽性對照。 l. 陰性對照 用已知確證為陰性的物質(zhì)加入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中所獲得的陰性值。它可以是不加任何處理的空白對照，也可以是溶劑對照?？瞻讓φ粘藷o處理因素外，其他因素與實(shí)驗(yàn)組完全相同，其目的是獲得實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。三、致突變實(shí)驗(yàn)中的一些問題 2. 陽性對照 用已知能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的物質(zhì)作為對照。目的是通過對陽性物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)方法可靠，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)者完成技術(shù)和鑒定致突變物的能力，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。 遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，設(shè)立陰性和陽性對照，控制影響實(shí)驗(yàn)的