可溶性型鴨肝炎病毒3d蛋白在制備病毒性疫苗的免疫增強(qiáng)劑中應(yīng)用

1、可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎的免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎的免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。背景技術(shù)鴨性肝炎（DVH），是由鴨肝炎（DHV）引起的雛鴨傳染病，以肝臟性炎癥為特征，表現(xiàn)為急性、高度接觸性和致死性，在新疫區(qū)的率達(dá) 90%以上。臨床特征主要表現(xiàn)為角弓反張（神經(jīng)癥狀）、肝臟腫大并見大小不一斑。鴨肝炎屬于小 RNA 病毒科（Picornaviridae）禽肝炎屬（Avihepato有三個(gè)型，分別為 DHAV-1、），本DHAV-2 和 DHAV-3，無免疫交叉反應(yīng)或免疫交叉反應(yīng)弱。在我國，主要流行 1 型鴨炎。性肝

2、目前對(duì) DHV 的控制主要依靠接種。雖然這些在控制鴨性肝炎方面起到了極大的作用，但也還存在諸多有待于改進(jìn)和提高的方面，因此有必要開拓研究及防控的新領(lǐng)域。其中免疫增強(qiáng)劑的研究即是重要方向之一。所謂免疫增強(qiáng)劑是一類通過非特異性途徑提高機(jī)體對(duì)抗原或微生物特異性反應(yīng)的物質(zhì)。自 1925 年法國免疫學(xué)家兼獸醫(yī) Gaston Ramon 發(fā)現(xiàn)在中加入某些與之無關(guān)的物質(zhì)可以特異地增強(qiáng)機(jī)體對(duì)白喉和破傷風(fēng)毒素的抵抗反應(yīng)以來, 在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，許多國家都不同程度地開展了這方面的研究。尤其是在工程技術(shù)飛速發(fā)展,工程不斷開發(fā)以及生活水平日益提高的今天，一方面工程需要加入佐劑提高其保護(hù)率；另一方面公眾健康意識(shí)日益

3、增強(qiáng)，免疫增強(qiáng)劑在醫(yī)療、方面的作用也越來越受到重視，因而免疫增強(qiáng)劑再次成為當(dāng)代免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。免疫增強(qiáng)劑可單獨(dú)或與抗原同時(shí)使用，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的物質(zhì)，可通過不同的作用方式增強(qiáng)機(jī)體的特異性和非特異性免疫應(yīng)答。目前，免疫增強(qiáng)劑的種類繁多，主要有 5 類：微生物來源的藥物（如卡介苗等）、生物因子類藥物（如胸腺素、IFN- 等）、人工類藥物（如左旋咪唑）、微量元素類（如硒、鋅等）、天然類藥物（如黃芪多糖等）。世界衛(wèi)生組織（WTO） 對(duì)免疫增強(qiáng)劑有五項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：（1）化學(xué)成分明確；（2）易于降解；（3） 刺1激作用適中；（4）無及致突變作用；（5）無毒性及不良反應(yīng)。目前專門針對(duì)鴨的免疫增強(qiáng)劑，特別是

4、針對(duì) I 型鴨肝炎的免疫增強(qiáng)劑較少。發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨3D 蛋性肝炎的免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供可溶性 I 型鴨肝炎預(yù)防 I 型鴨性肝炎免疫制劑中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：1、可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎的免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述免疫增強(qiáng)劑為細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑或體液免疫增強(qiáng)劑。2、可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋預(yù)防 I 型鴨性肝炎免疫制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明中可溶性 3D 蛋白由如下方備：包括如下步驟：將 SEQ ID NO.3 所示序列的第91376 位核苷酸連接于 pET-3

5、2(a)+載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，然后以大腸桿菌 Rosetta、BL21或 BL21(DE3)PLYS 為宿主菌，在抗性的 LB 培養(yǎng)基中活化后，在 IPTG 終濃度為 0.21.0mmol/L、溫度為 2039 條件下誘導(dǎo)表達(dá) 412 小時(shí)。其中宿主菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)PLYS；誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件為 IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L、溫度為 25條件下誘導(dǎo)表達(dá) 6 小時(shí)；活化的具體步驟為：將表達(dá)菌株接種于抗性的 LB 培養(yǎng)基中，在 37、120 r/min 條件下過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與培養(yǎng)至 OD600 為 0.6 即可。抗性的 LB 培養(yǎng)基按體積比為 1：100

6、擴(kuò)大表達(dá)后還包括純化步驟，具體如下：收集菌液，在 12000 r/min 條件下離心 10 min 后收集菌體，收集的菌體用 20 mmol/L、為 8.0 的 Tris-HCl 懸浮，然后在冰浴下超聲，將破碎后的菌體在 4、12000r/min 條件下離心 10min，收集上清，上清用 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化，透析，用 0.45 m 的濾膜超濾得純化的可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白。冰浴下超聲最佳條件為在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec。本發(fā)明的有益效果在于：可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用，將可溶性 I 型鴨肝炎3D

7、蛋白單獨(dú)免疫或與 I 型鴨性肝炎共免疫鴨后能夠增加 CD8+ T 淋巴細(xì)胞數(shù)量，并且提高 IL-2、IL-4 和 IFN- 等細(xì)胞因子的含量，表明能夠增強(qiáng)免疫鴨的細(xì)胞免疫和體液免疫力，同時(shí)經(jīng)攻毒保護(hù)試驗(yàn)和解剖分析還可以得出免疫可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白后還能降低免疫鴨攻毒后的病變和致死率，為免疫預(yù)防 I型鴨肝炎奠定了基礎(chǔ)。2附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：圖 1 為 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果（M：DL 2000Marker，1：3DPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物）。圖 2 為I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3D載體構(gòu)建過

8、程中PCR 鑒定和酶切鑒定結(jié)果（A：pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒 PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1：PCR 產(chǎn)物；B： pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒酶切鑒定，M：DL15000 Marker，1：Kpn/Xho雙酶切條帶， 2：Xho單酶切條帶；C：pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的 PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1：PCR 產(chǎn)物；D：pET32a+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的酶切鑒定，1：Kpn/Xho雙酶切結(jié)果，2：Xho單酶切條帶）。圖 3 為可溶性 3D 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化（M 為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；A：表

9、達(dá)菌的篩選，1 為 pET-32(a)+空載體表達(dá)產(chǎn)物，2-4 分別為 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Rosetta、BL21 和 BL21(DE3)PLYS 三種不同表達(dá)宿主菌的表達(dá)產(chǎn)物；B：誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化，1-5 依次為誘導(dǎo) 12 h、10 h、8 h、6 h 和 4 h 的 BL21(DE3)PLYS 宿主菌表達(dá)產(chǎn)物；C：誘導(dǎo)表達(dá)溫度的優(yōu)化，1-6 分別為 39、37、35、30、25和 20的 BL21(DE3)PLYS宿主菌表達(dá)產(chǎn)物；D：IPTG 濃度優(yōu)化，1-5 分別為 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol

10、/L 和 1.0 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物。圖 4 為可溶性 3D 蛋白 Western-blot 檢測及純化蛋白電泳（A 為 3D 蛋白的免疫印跡檢測結(jié)果，M 為蛋白質(zhì) Marker，1 為 3D 蛋白印跡。B 為 SDS檢測純化的 3D 蛋白，M 為低分子量蛋白質(zhì) Marker，1 為純化的 3D 蛋白）。圖 5 為攻毒的鴨及肝臟（A：攻毒鴨顯著的角弓反張； B：攻毒鴨肝臟特征性）。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J. 薩姆等著）中所述的條件，或按照制造廠商所

11、建議的條件。實(shí)施例 1、克隆 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DI 型鴨肝炎株 H（DHAV-H）（GenB：JQ301467）、E. coli DH5 菌種和 pET-32(a)+3載體均由禽病防治保存并提供。各種分子生物學(xué)試劑購于生物試劑公司。根據(jù) DHAV-H 的引物如下：組序列（GenB：JQ301467）設(shè)計(jì)擴(kuò)增 3D的引物，具體P1：5-ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3（SEQ ID NO.1），下劃線表示 Kpn酶切位點(diǎn)；P2：5-acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3（SEQ ID NO.2），下劃線表示 Xh

12、o酶切位點(diǎn)；然后將設(shè)計(jì)的引物由寶生物工程（大連）。取保存的 DHAV-H液以滅菌 PBS 作 5 倍稀釋，添加 1/100 體積的雙抗（青霉素、鏈霉素的終濃度分別為 100IU/mL 和 100g/mL）后于 37 溫育 1 h，然后接種 9 日齡發(fā)育良好、無母源抗體的鴨胚，棄去 24 h 內(nèi)胚，收集 2472 h胚的尿囊液及胚體，按照 Trizol 試劑盒將提取的提取RNA。cDNA，然后以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄RNA 反轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴(kuò)增體系如表 1 所示。表 1反轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?0 10 min，42 15 min，95 5 min，4 5

13、 min，循環(huán)一次；PCR程序?yàn)椋?4預(yù)變性 5 min；94變性 40 sec，56退火 40 sec，72后延伸 30 sec，30 個(gè)循環(huán)，最后 72后延生 10 min。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 1 所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得長度約 1386bp 的片段（不包括內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)性堿基為 1368bp），其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示，與預(yù)期片段大小相同，因此按照天根生化科技()的膠回收試劑盒回收目的條帶，回收獲得的片段命名為 DHAV-H-3D。實(shí)施例 2、構(gòu)建表達(dá) I 型鴨肝炎株 H 3D 蛋白的表達(dá)載體將回收的 DHAV-H-3D 與 pJET1

14、.2 載體連接，連接反應(yīng)參照 pJET1.2 克隆試劑盒4RTPCR5*PrimescriptTM Buffer2 LPrimescript RTase Mix0.5 L下游引物P21 LRNA2 LRNAase Free 水4.5 L小計(jì)10 L2*Prime Star Mix12.5 L上游引物P1（10pmol/L）1 L下游引物P2（10pmol/L）1 LcDNA1 L滅菌蒸餾水9.5 L小計(jì)25 L進(jìn)行，反應(yīng)體系如表 2 所示。表 2、連接 DHAV-H-3D 與 pJET1.2 載體項(xiàng)目體積2Reaction Buffer DHAV-H-3D 回收產(chǎn)物 pJET1.2 載體水（n

15、uclease free） T4 DNA-ligase小計(jì)10 L1 L1 L7 L1 L20 L按表 2 體系混合后進(jìn)行瞬時(shí)離心，然后在 20條件下連接 15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5抗性的 LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，并將篩選菌落用 SEQ ID NO.1感受態(tài)細(xì)胞，并用和 SEQ ID NO.2 所示序列為引物進(jìn)行 PCR 檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2 中 A 所示。結(jié)果顯示，篩選獲得了陽性克隆。為了進(jìn)一步檢測陽性克隆，將陽性克隆的菌株提取質(zhì)粒，然后經(jīng) Kpn和 Xho雙酶切及 Xho單酶切鑒定，酶切體系如表 3 所示。表 3、Kpn及 Xho酶切鑒定反應(yīng)體系單酶切體

16、系雙酶切體系10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L11.5 L/ 1 L25 L10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L10.5 L1 L1 L25 L滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水KpnXho小計(jì)KpnXho小計(jì)按表 3 體系混合后瞬時(shí)離心，然后于 37條件水浴 3h，反應(yīng)結(jié)束將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖 2 中 B。結(jié)果顯示，DHAV-H-3D 片段正確連入 pJET1.2 載體中，并命名為 pJET-1.2+/DHAV-H-3D。將 pJET-1.2+/DHAV-H-3D 送 Invitrogen 公司篩選未突變的序列用于構(gòu)建表達(dá)載體。，取正確的 pJET-1.2+/DHA

17、V-H-3D 和pET-32(a)+載體分別用 Kpn和 Xho進(jìn)行雙酶切，回收 3D及載體骨架，然后按表 4 所示體系進(jìn)行連接。表 4、3D及載體骨架連接體系項(xiàng)目體積55.5 L 2 L7.5 L15 L目的pET32a+回收液2Ligation mix小計(jì)按表 4 體系混合后瞬時(shí)離心，然后于 16條件下過夜連接，得 pET-32(a)+/DHAV-H-3D質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5 宿主菌，以抗性 LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，然后進(jìn)行 PCR鑒定，結(jié)果如圖 2 中 C 所示。然后將 PCR 鑒定為陽性的菌株用于提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒用Kpn和 Xho進(jìn)行雙酶切及 Xho進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行

18、瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2 中 D 所示。由圖 2 中 C 和 D 可知，3D及載體骨架正確連接。實(shí)施例 3、I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的表達(dá)表達(dá)宿主菌大腸桿菌（ Escherichia coli ） Rosetta 、大腸桿菌 BL21 和大腸桿菌BL21(DE3)PLYS 菌種均由禽病防治保存；含 I 型鴨肝炎株 H 3D蛋白的表達(dá)載體 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 由實(shí)施例 2 中構(gòu)建；各種分子生物學(xué)試劑購于生物試劑公司。將實(shí)施例 2 獲得的 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 BL21 、 Rosetta 和BL21(DE3)PLYS 表達(dá)菌

19、，轉(zhuǎn)化菌于過夜培養(yǎng)，次日將過夜培養(yǎng)物與新鮮抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中 37、120 r/min 條件下抗性的 LB 液體培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴(kuò)大培養(yǎng)約 3 小時(shí)，菌液 OD600 達(dá) 0.6 時(shí)加入 IPTG 至終濃度為 0.2 mmol/L，并在 37下誘導(dǎo)12 h，然后收集菌液，將菌液在 12000 r/min 條件下、離心 10 min，菌體用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）按 1:10（V/V）懸浮。同時(shí)以 pET-32(a)+載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)表達(dá)菌作為對(duì)照。為了篩選表達(dá)出可溶性 3D 蛋白的表達(dá)菌，然后將上述制得的懸浮菌液在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec

20、/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后的菌液在 4、12000r/min條件下離心 10min，棄沉淀（為不溶性包涵體表達(dá)蛋白），收集上清（為可溶性表達(dá)蛋白）。吸取 80L 上清，加入 20L 含-巰基乙醇的 5SDS 上樣buffer，煮沸 10min 后在 12000r/min條件下常溫離心 5min，然后進(jìn)行 SDS電泳檢查，結(jié)果如圖 3 中 A 所示。結(jié)果顯示，通過將重組質(zhì)粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 轉(zhuǎn)化到三種表達(dá)菌后，在約 68 kD 處出現(xiàn)了目的條帶，而對(duì)照不含有此條帶，并且轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)PLYS 菌株的蛋白表達(dá)量最大、BL21的表達(dá)量次之，所以根

21、據(jù)表達(dá)量篩選出最佳表達(dá)菌為 BL21(DE3)PLYS。I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化：（1）IPTG 濃度的優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS6菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的 LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至終濃度分別為 0.2 mmol/L、 0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L 和 1.0 mmol/L，然后在 37條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 12 h，然后用 SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖 3 中

22、 B 所示。結(jié)果顯示，IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L條件下可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量最高，即 IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L 為最適濃度。（2）誘導(dǎo)表達(dá)溫度優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 6抗性的 LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后分別于溫度為 20、 25、30、35、37和 39條件下誘導(dǎo) 12 h，然后用 SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖 3 中 C 所示。結(jié)果

23、顯示，溫度在 25條件下可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量最高，即誘導(dǎo)溫度為 25為最適表達(dá)溫度。（3）誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的 LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后于溫度為 25條件下誘導(dǎo) 4 h、6 h、8 h、10 h 和 12 h，然后用 SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量，結(jié)果如圖 3 中 D 所示。結(jié)果顯示，溫度在誘導(dǎo)表達(dá) 6h 后可溶性 3D 蛋白的表達(dá)量以達(dá)到最高，

24、即誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為 6h。經(jīng)過上述優(yōu)化，可以看出含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌最優(yōu)表達(dá)條件為 0.8 mmol/L IPTG、25誘導(dǎo) 6 h。后續(xù)按照此條件對(duì) 3D 蛋白進(jìn)行大量表達(dá)。I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白 Western-blot 檢測，具體步驟如下：按最優(yōu)表達(dá)條件表達(dá)可溶性 3D 蛋白，然后進(jìn)行 SDS，隨后將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，80 V 轉(zhuǎn)印 90 min，轉(zhuǎn)印完畢后將 PVDF 膜取出，以 1% BSA 于 37 搖動(dòng)孵育 1 h，然后以1：100 稀釋的抗 DHAV 的 IgG 在 37搖動(dòng)孵育

25、 1 h 后取出，以 TBS 洗滌 3 次，每次 2 min，隨后以 1：3000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的二抗 IgG 于 37搖動(dòng)孵育 1 h，以 TBS 洗滌后按照 DAB顯色，待目的條帶清晰可見時(shí)以蒸餾水沖洗終止顯色，結(jié)果如圖 4 中 A顯色試劑盒所示，最后將 PVDF 膜干燥避光保存。I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的純化：將含重組質(zhì)粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 的BL21(DE3)PLYS 在最適條件下表達(dá)，然后收集菌體，用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）懸浮后在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后的

26、菌液在 4、712000r/min 條件下離心 10min，收集上清（為可溶性表達(dá)蛋白）；然后將收集的上清在 Bio-rad公司提供的 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化（純化液及純化方法按試劑盒進(jìn)行），將收集的純化蛋白液進(jìn)行透析后用 0.45m 的濾膜超濾，最后置于 4、-20、-70或凍干保存。將純化后的可溶性 3D 蛋白進(jìn)行 SDS電泳，結(jié)果如圖 4 中 B 所示。結(jié)果顯示表達(dá)的 3D 蛋白經(jīng) Ni2+-NTA 親和純化后，得到了純度、濃度均較高的蛋白，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定蛋白濃度為 1.5 mg/mL。實(shí)施例 4、可溶性 3D 蛋白對(duì) I 型鴨肝炎將鴨分為 3D 蛋白組（P 組）、3D 蛋

27、白+免疫鴨的細(xì)胞免疫增加作用組（P+V 組）、組（V 組）及對(duì)照組（C組），然后按照表 5 的免疫劑量和途徑進(jìn)行免疫和注射。表 5、動(dòng)物分組及免疫組別動(dòng)物數(shù)量免疫時(shí)間免疫途徑及劑量3D 蛋白組（P）101 日齡皮下，0.1 mg 蛋白3D 蛋白+鴨肝炎組（P+V）101 日齡皮下，0.05 mg 蛋白+1 羽份弱毒劑量鴨肝炎組（V）101 日齡肌肉注射,1 羽份對(duì)照組（C）101 日齡皮下，生理鹽水免疫后 7 天采血，測定 CD8+ T 細(xì)胞亞群和免疫細(xì)胞因子，檢測方法按照試劑盒進(jìn)行，結(jié)果如表 6 所示。表6、CD8+ T 細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測結(jié)果檢 測對(duì)象組別PP+VVCCD8+ IL-2

28、 IL-4IFN-r0.2810.0300.2990.0280.2790.0100.2070.0320.2880.0290.3110.0280.2420.0210.2010.0180.2780.0270.2550.0230.2220.0190.1980.0250.2520.0340.2410.0930.200.1090.1570.032結(jié)果顯示，免疫后 7 天各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞因子水平均有所上升。由于細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞所的小分子多肽，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化、免疫功能，參與炎癥發(fā)生和愈合等作用。根據(jù)免疫應(yīng)答類型可將細(xì)胞因子分為Th1 型和Th2 型。Thl型有 IL-2、IFN-、腫瘤壞死因子（TN

29、F）和淋巴毒素（LT），主要由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)過程產(chǎn)生。Th2 細(xì)胞因子由 B 細(xì)胞的激活過程產(chǎn)生，包括 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-l3。IL-2、IL-4 和 IFN- 均是重要的免疫指標(biāo)。在免疫應(yīng)答過程中，IL-2 是細(xì)胞免疫的初始8因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生 干擾素，IFN- 又稱免疫干擾素，是 T 細(xì)胞免疫的一個(gè)重要指標(biāo)。IL-2 刺激 Thp 細(xì)胞向 Th0 細(xì)胞分化，Th0 細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-5 和 IFN-，通常又以 IL-4 代表體液免疫水平，IFN- 代表細(xì)胞免疫水平，IL-4/IFN- 的比值可以反應(yīng)Th2/Th1 細(xì)胞的平衡狀態(tài)。IL-2、

30、IFN- 還是參與機(jī)體抗續(xù)存在和增殖，IFN- 能直接抑制免疫機(jī)制的重要細(xì)胞因子。IL-2 能維持免疫細(xì)胞的持。CD8+ T 淋巴細(xì)胞數(shù)量也是體現(xiàn)反應(yīng)免疫水平的指標(biāo)，CD4+和 CD8+兩種細(xì)胞的含量也能反應(yīng)抗原遞呈的先后順序，反應(yīng)免疫激發(fā)的機(jī)制。故本實(shí)施例對(duì) CD8+ T 淋巴細(xì)胞數(shù)量，IL-2、IL-4 和 IFN- 等細(xì)胞因子進(jìn)蛋白對(duì)雛鴨免疫增強(qiáng)作用的基本數(shù)據(jù)。定，以獲取 3D上述結(jié)果可以看出，CD8+的水平呈現(xiàn)出與細(xì)胞因子相似的變化趨勢，表明在免疫后，機(jī)體的細(xì)胞免疫得到了激發(fā)。這幾個(gè)因子的水平升高與 ELISA 抗體水平升高是相符的。P 組IFN- 的水平較其余三組高，表明3D 蛋白能

31、刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫。對(duì)比P+V 組和V組，從IL-2、IL-4 的水平推測整體的免疫水平上看，3D 蛋白能增強(qiáng)的免疫能力，而IL-4上升的幅度不大，暗示 3D 刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫強(qiáng)于體液免疫。綜上，激雛鴨增強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫，而且細(xì)胞免疫強(qiáng)于體液免疫。的 3D 蛋白能刺實(shí)施例 5、可溶性 3D 蛋白對(duì) I 型鴨肝炎免疫鴨的體液免疫增加作用將動(dòng)物分為 3D 蛋白組（P 組）、3D 蛋白+組（P+V 組）、組（V 組）及對(duì)照組（C 組），按照表 7 的免疫劑量和途徑進(jìn)行免疫和注射。表 7、動(dòng)物分組及免疫組別動(dòng)物數(shù)量免疫時(shí)間免疫途徑及劑量3D 蛋白組（P）101 日齡皮下，0.1 mg 蛋白3D 蛋白+鴨肝炎組（P+V）101 日齡皮下，0.05 mg 蛋白+1 羽份弱毒劑量鴨肝炎組（V