細(xì)胞生物學(xué)實驗手冊：電子顯微鏡生物標(biāo)本的制備及觀察

1、實驗十七 電子顯微鏡生物標(biāo)本的制備及觀察【實驗?zāi)康摹苛私怆娮语@微鏡的基本原理及電鏡生物標(biāo)本的制備方法和觀察?！緦嶒炗闷贰?一、材料和標(biāo)本 家兔一只。 二、器材和儀器 H600透射電子顯微鏡、S450掃描電子顯微鏡、超薄切片機(AO型)、解剖鏡、震蕩器、恒溫箱、臨界點干燥器、JB一3型離子鍍膜機、單面刀片、銅網(wǎng)、解剖器材。 三、試劑 乙醚、2.5戊二醛(0.1molL(pH7.4)二甲砷酸鈉緩沖液配制)、1鋨酸、30、50、70乙醇溶液、80、90、95、100丙酮溶液、環(huán)氧樹脂(Epon812)包埋劑、醋酸鈾染液、檸檬酸鉛染液、雙蒸水、2單寧酸、乙酸異戊脂、液態(tài)CO2。【實驗內(nèi)容】一、透射電子

2、顯微鏡的標(biāo)本制備及觀察(一)原理 電子顯微鏡是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具，它以電子束為照明源，利用電子流具有波動的性質(zhì)，在電磁場的作用下，電子改變前進軌跡，產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)、聚焦，因而電子束透過標(biāo)本后在電磁透鏡的作用下可放大成像。高速運動的電子流其波長遠(yuǎn)比光波波長短，所以電鏡分辨率遠(yuǎn)比光鏡高，可達0.14nm，放大倍率可達80萬倍。由熱陰極發(fā)射的電子在20100千伏加速龜壓作用下，經(jīng)聚光鏡聚焦成束，投射到很薄的標(biāo)本上，并與標(biāo)本中各種原子的核外電子發(fā)生碰撞，造成電子散射，在細(xì)胞質(zhì)量和密度較大的部位，電子散射度強，成像較暗。在質(zhì)量、密度較小處電子散射弱，成像較亮，結(jié)果在熒光屏上形成與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相應(yīng)的黑白圖像。

3、 (二)主要結(jié)構(gòu) 電子顯微鏡由電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)三大部分組成(圖17一l，圖172)。 1電子光學(xué)系統(tǒng)是電鏡的主體，對成像和像的質(zhì)量起著決定性作用。它是由電子槍、聚光鏡、樣品室、物鏡、中間鏡、投影鏡、觀察室和照像室等部分構(gòu)成。 2真空系統(tǒng)主要是使鏡筒內(nèi)保持高度真空，一般要求達到10-4托（1托=lmmHg），是通過機械泵和油擴散泵接力排氣及真空墊圈的密封作用來實現(xiàn)的。真空度可由真空表指示。由于電鏡利用高速電子束為照明源，裁要求在電子束的通道上不能有游離氣體存在，以免與氣體分子碰撞引起電離、放電、電子散射、燈絲氧化、樣品被污染等而影響觀察效果或發(fā)生故障。 3供電系統(tǒng)主要是提供穩(wěn)定的

4、電源，包括高壓系統(tǒng)電源、各透鏡的電源及真空泵的電源等。 (三)透射電鏡生物標(biāo)本超薄切片的制備(以家兔肝臟為例)。 1取材 取活兔用乙醚麻醉，迅速打開腹腔，暴露肝臟，用鋒利的刀片切取lmm3肝組織，立即投入固定液中。取材要求迅速，通常將動物麻醉取材。如動物處死后取材，要在幾分鐘內(nèi)完成。取材最好在低溫條件下進行(04)，以防止動物死后細(xì)胞缺氧發(fā)生超微結(jié)構(gòu)變化。圖171 透射電鏡結(jié)構(gòu) 2固定 把肝組織立即投入到0.1molL(pH7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5戊二醛中，4固定二小時(也可用0.1molL(pH7.4)的磷酸緩沖液配制的2.5戊二醛)。然后用0.1molL(pH7.4)的二甲砷

5、酸鈉緩沖液洗三次，再放入用相同緩沖液配制的1鋨酸中固定2小時(4)。固定的作用是用化學(xué)試劑使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)如同生前狀態(tài)精確地保存下來。固定劑應(yīng)能迅速進入細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其不變形，在脫水過程中不丟失細(xì)胞成分。 3脫水 用雙蒸水清洗固定好的肝臟標(biāo)本，按順序投入到30、50、70的乙醇中，在4條件下各lO分鐘然后再投入到80、90、95的丙酮中各10分鐘，100的丙酮中兩次，每次10分鐘，一般可在室溫下進行(如實驗需中途停頓可把標(biāo)本放在70乙醇中過夜)。脫水的目的是用脫水劑，把組織細(xì)胞內(nèi)的游離水去除干凈，使包埋劑能夠均勻地滲入細(xì)胞內(nèi)。 4浸透 把標(biāo)本由100丙酮中移入裝有混勻包埋劑的小瓶中，在

6、30下震蕩4小時(可用紅外線燈加溫促進浸透)使包埋劑置換出標(biāo)本中的丙酮。電鏡生物標(biāo)本常用環(huán)氧樹脂作包埋劑，聚合后可切成超薄切片，并耐電子束轟擊。 5包埋 把標(biāo)本放入膠囊底部，將混勻的包埋劑分裝入膠囊中，加好標(biāo)簽，勿使傾倒保持直立。 6聚合 把裝有標(biāo)本和包埋劑的膠囊置35、45、60溫箱中各24小時，使包埋劑聚合，硬化，由流體變?yōu)榫鶆虻墓腆w。這樣在切片時，包埋在其內(nèi)的肝組織才能保持結(jié)構(gòu)不變。 7超薄切片 一般透射電鏡的切片厚度不能超過100nm，厚于100nm的切片電子束不能穿透或影響觀察效果。通常超薄切片厚度為5070nm。在切片前，要對標(biāo)本包埋塊頂端修成近45角的四邊錐體，使要進行切片的標(biāo)本

7、露出外表面，呈長寬約為0.40.6mm的長方形或梯形切面。然后再把標(biāo)本塊夾在標(biāo)本夾中，并把它固定在切片機臂的遠(yuǎn)端。切片刀是用玻璃制成(也可用鉆石刀)，甩膠布圍成水槽，裝滿水，切下的切片漂在水面，用銅網(wǎng)收集。切片的厚度可以從切片與水面反射光所產(chǎn)生的干涉色來判斷。 目前公認(rèn)的樹脂包埋切片厚度與干涉色關(guān)系如下： 8超薄切片機的操作(示教) 9染色 在平皿中放一臘紙片，滴一滴醋酸鈾染液于臘紙上，用彎頭小鑷子夾住銅網(wǎng)邊緣，把貼有切片的一面朝下，輕輕插入染液中，蓋上平皿蓋，室溫下染色1020分鐘。水洗后同上法再置入檸檬酸鉛染液中染色15分鐘，1NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后觀察。染色的原理是利用重金

8、屬(如鉛、鈾等)與組織中某些成分結(jié)合，可提高這些組分對電子的散射能力，增進超薄切片中不同組織成分對電子散射的差異，使細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)得到充分表現(xiàn)，形成與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相應(yīng)的圖像，并提高圖像反差，也稱電子染色。 (四)觀察家兔肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 1電鏡操作(示范) 2肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 肝細(xì)胞為多角形，一側(cè)靠近血竇。核圓形12個，位于細(xì)胞中央，核仁12個。細(xì)胞質(zhì)中有各種細(xì)胞器，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜平行排列，聚集在一起?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)為分支彎曲的囊管組成，互相吻合成網(wǎng)，排列密集。高爾基復(fù)合體排列在核的周圍。還可見到溶酶體、過氧化物體、糖原、脂滴、分泌顆粒等。 二、掃描電子顯微鏡的標(biāo)本制備和觀察 (一)原理 電子槍發(fā)射出的熱

9、電子，在加速電壓作用下，形成高速電子流，經(jīng)聚光鏡和物鏡的作用形成一極細(xì)的電子束，掃描于標(biāo)本表面。入射電子與標(biāo)本中的原子相互作用產(chǎn)生二次電子，二次電子的數(shù)量和每個電子的能量隨標(biāo)本表面形狀及元素成分的不同而變化。二次電子被接收并經(jīng)過放大，即可在熒光屏上顯現(xiàn)出被放大的標(biāo)本表面圖像。 (二)掃描電鏡的構(gòu)成(圖172) (三)掃描電鏡標(biāo)本制備(以家兔支氣管為例) 1取材 麻醉家兔，解剖暴露支氣管，用刃器切取小段支氣管，剖開，再切取25mm大小的一塊管壁，保護要觀察的內(nèi)表面(即粘膜面)，并用緩沖液或生理鹽水清洗二次。如粘膜表面有較多粘液時，可用胰酶溶液消化，再清洗。 2固定 把標(biāo)本迅速投入固定液中，其固定

10、程序與透射電鏡標(biāo)本同。3導(dǎo)電處理 把經(jīng)鋨酸固定的標(biāo)本清洗后放入2單寧酸中處理10分鐘，再用雙蒸水清洗3次，然后放入l鋨酸中處理30分鐘。 4脫水 把用雙蒸水洗過的標(biāo)本依次放入30、50、70、80、90、95、100乙醇中脫水各lO分鐘，然后將標(biāo)本移入乙酸異戊酯中，置換出乙醇。5臨界點干燥 將標(biāo)本置入臨界點千燥器的密閉標(biāo)本室中，打開進氣閥門，充入液圖172 掃描電子顯微鏡構(gòu)造原理及主要部件體CO2，其量不少于標(biāo)本室容積的23。關(guān)閉開關(guān)，并升溫使達到臨界狀態(tài)(31.4,72.8大氣壓)，此時液態(tài)與氣態(tài)界面消失。加溫過程中溫度可達40，標(biāo)本室內(nèi)壓力可達80120大氣壓，然后緩慢放氣，放氣時間不應(yīng)少于2小時。 臨界點干燥是掃描電鏡標(biāo)本制備的一種重要干燥方法，它能消除表面張力，使標(biāo)本在干燥過程中不損傷、不變形。 6鍍膜 把干燥的標(biāo)本用導(dǎo)電膠固定在標(biāo)本臺上(注意觀察面向上)，把標(biāo)本臺放在離子鍍膜機陽極載臺上，在低真空下(0.1Torr)加高電壓(10001200伏)使陰極(金靶)與陽極間形成電場，把殘存的氣體分子電離，陽離子打向金靶，金原子濺射出來落在標(biāo)本表面，形成