生化技術(shù)1課件

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)楊建雄導(dǎo) 論1 生物化學(xué)與分子生物學(xué)的定義 生物化學(xué)(1877年詞匯出現(xiàn)，上世紀(jì)初形成學(xué)科）是用化學(xué)的理論和方法研究生命現(xiàn)象的科學(xué)。 分子生物學(xué)（上世紀(jì)70年代形成較完整的學(xué)科，出現(xiàn)教科書）是研究生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科，狹義的分子生物學(xué)只研究基因的表達(dá)及其調(diào)控。 生物化學(xué)與分子生物學(xué)是同一個(gè)二級學(xué)科，在大學(xué)本科階段可以作為兩門課開設(shè)， 也可以作為一門課開設(shè)。2 生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究范疇2.1 生物體的組成物質(zhì) 即靜態(tài)生物化學(xué)，重點(diǎn)是糖類、脂類、蛋白質(zhì)、酶、核酸的結(jié)構(gòu)和功能。 復(fù)雜性: 組成物質(zhì)多；分子大；空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜。 規(guī)律性: 元素構(gòu)件小分子聚合物（生物大分

2、子）；結(jié)構(gòu)與功能相適應(yīng)。 方法：分離純化；序列分析；結(jié)構(gòu)和功能的研究。免疫球蛋白部分分子的空間結(jié)構(gòu)2.2 物質(zhì)和能量代謝（動態(tài)生物化學(xué)） 重點(diǎn)是糖類和氨基酸的分解代謝、脂類和核苷酸的分解和合成代謝，及物質(zhì)代謝和能量代謝的關(guān)系，還應(yīng)熟悉氨基酸生物合成、光合作用和生物固氮的概況。復(fù)雜性 多步化學(xué)反應(yīng)構(gòu)成代謝途徑； 多條代謝途徑相互交織成網(wǎng)； 物質(zhì)代謝和能量代謝相互交織； 調(diào)節(jié)控制有條不紊。規(guī)律性 反應(yīng)類型不多； 反應(yīng)機(jī)理符合有機(jī)化學(xué)理論； 調(diào)節(jié)控制與生物學(xué)功能相適應(yīng)。方法 分析中間代謝物； 示蹤技術(shù)； 酶學(xué)研究（包括使用抑制劑）； 研究缺陷性和疾病模型。1點(diǎn)1線或1點(diǎn)2線:410個(gè)；1點(diǎn)3線:71

3、個(gè)；1點(diǎn)4線:20個(gè)；1點(diǎn)5線:11個(gè)；1點(diǎn)6線或6線以上:8個(gè)；1點(diǎn)1線在1個(gè)途徑的末端；1點(diǎn)2線在1個(gè)途徑的中間；1點(diǎn)3線參與2個(gè)途徑；其余類推。3 生物化學(xué)與分子生物學(xué)同生產(chǎn)實(shí)踐的關(guān)系啟蒙階段 食品選擇和加工； 醫(yī)療。發(fā)展階段 維生素、抗生素醫(yī)療； 代謝食品、醫(yī)療； 分子生物學(xué) 基因工程、蛋白質(zhì)工程。發(fā)展前景 生物制品； 轉(zhuǎn)基因動植物； 基因芯片； 基因診斷； 基因治療。5 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展簡史1920年代 微量分析技術(shù)導(dǎo)致了維生素、激素和輔酶等的發(fā)現(xiàn)。 瑞典著名的化學(xué)家Svedberg奠基了超離心技術(shù)的理論基礎(chǔ)，1924年制成了第一臺5000 RCF的離心機(jī)（5000 r/min8

4、000 r/min，相對離心力“RCF”的單位可表示為“g”)，并準(zhǔn)確測定了血紅蛋白等復(fù)雜蛋白質(zhì)的分子量，獲得了1926年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1930年代 電子顯微鏡技術(shù)打開了微觀世界，使我們能夠看到細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和某些生物大分子的大致結(jié)構(gòu)。 美國哈佛大學(xué)的Folin教授和中國的吳憲教授建立了不少生物化學(xué)常用的分析方法如血糖分析、蛋白質(zhì)含量分析、氨基酸測定等。 1935年Schoenheimer和Rittenberg首次將放射性同位素示蹤用于碳水化合物及類脂物質(zhì)的中間代謝的研究，1937年英藉德裔生物化學(xué)家Krebs發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)，對細(xì)胞代謝及分子生物學(xué)的研究作出了重要貢獻(xiàn)，他與美藉德裔生物化學(xué)家

5、Lipmann共獲1953年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1940年代 兩位英國科學(xué)家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。由此，層析技術(shù)成為分離生化物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)。 電泳技術(shù)由瑞典的著名科學(xué)家Tisellius奠基，從而開創(chuàng)了電泳技術(shù)的新時(shí)代，他因此獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 層析技術(shù)和電泳技術(shù)用于分析生物大分子的組成和代謝的中間產(chǎn)物，示蹤技術(shù)的應(yīng)用推動了代謝的研究。 美國化學(xué)家Pauling確認(rèn)氫鍵在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中以及生物大分子間相互作用的重要性，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的-螺旋，并因此而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1950年代 放射性同位素示蹤技術(shù)有了大的發(fā)展，為各

6、種生物化學(xué)代謝過程的闡明發(fā)揮了重要作用。 1953年Wilkins和Franklin通過對DNA分子的X-射線衍射研究為Watson和Crick的DNA模型提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，美國科學(xué)家Watson和英國科學(xué)家Crick提出DNA分子的雙螺旋模型，1962年與英國科學(xué)家Wilkins分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)， DNA雙螺旋模型的提出開創(chuàng)了生物科學(xué)的歷史新紀(jì)元。 英國物理學(xué)家Perutz對血紅蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行X-射線結(jié)構(gòu)分析, Kendrew測定了肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)，成為研究生物大分子立體結(jié)構(gòu)的先驅(qū)，他們同獲1962年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 英國生物化學(xué)家Sanger還于1953年確定了牛胰島素中氨基酸的順序而

7、獲得1958年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1956年Arthur Kornberg發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I，美藉西班牙裔科學(xué)家Uchoa發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了將基因內(nèi)的遺傳信息通過RNA中間體翻譯成蛋白質(zhì)的過程。兩人分享了1959年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 美國生物化學(xué)家Nirenberg在破譯遺傳密碼方面作出了重要貢獻(xiàn)，Holly闡明了酵母丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸排列順序，后來證明所有tRNA的結(jié)構(gòu)均相似。美藉印度裔生物化學(xué)家Khorana提出按預(yù)定的序列合成核酸分子的方法。他們3人共獲1969年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 法國生物學(xué)家Lwoff因發(fā)現(xiàn)溶原現(xiàn)象，Jacob和生物化學(xué)家Monod由于發(fā)現(xiàn)

8、操縱子，而分享1965年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1970年代： 基因工程技術(shù)取得了突破性的進(jìn)展，Arber，Smith和Nathans三個(gè)小組發(fā)現(xiàn)并純化了限制性內(nèi)切酶，1972年，美國斯坦福大學(xué)的Berg等人首次用限制性內(nèi)切酶切割了DNA分子，并實(shí)現(xiàn)了DNA分子的重組。1973年，又由美國斯坦福大學(xué)的Cohen等人第一次完成了DNA重組體的轉(zhuǎn)化技術(shù)，這一年被定為基因工程的誕生年，Cohen成為基因工程的創(chuàng)始人，從此，生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)新的大發(fā)展時(shí)期。與此同時(shí)，各種儀器分析手段進(jìn)一步發(fā)展，制成了DNA序列測定儀、DNA合成儀等。 1984年德國科學(xué)家Kohler、美國科學(xué)家Milstein和丹麥科學(xué)家

9、Jerne由于發(fā)展了單克隆抗體技術(shù)，完善了極微量蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)而共享了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1985年美國加利福尼亞州Cetus公司的Mullis等發(fā)明了用PCR技術(shù)（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA的技術(shù)，對于生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究工作具有劃時(shí)代的意義，因而與第一個(gè)設(shè)計(jì)基因定點(diǎn)突變的Smith共享1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 1988年，美國遺傳學(xué)家McClintock由于在二十世紀(jì)五十年代提出并發(fā)現(xiàn)了可移動的遺傳因子而獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1989年，美國科學(xué)家Altman和Cech由于發(fā)現(xiàn)某些RNA具有酶的功能（稱為核酶）而共享諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

10、。1990年代： 1993年，美國科學(xué)家Roberts和Sharp由于在斷裂基因方面的工作而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1994年，美國科學(xué)家Gilman和Rodbell由于發(fā)現(xiàn)了G蛋白在細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)中的作用而分享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 1995年，美國科學(xué)家Lewis、德國科學(xué)家Nusslein-Volhard和美國科學(xué)家Wieschaus由于在20世紀(jì)4070年代先后獨(dú)立鑒定了控制果蠅體節(jié)發(fā)育基因而共享諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 質(zhì)譜技術(shù)用于蛋白質(zhì)的序列測定，核磁共振技術(shù)用于蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究，推動了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。 進(jìn)入21世紀(jì)以來，PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)不斷完善，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息

11、學(xué)發(fā)展迅速。1930Fischer德國研究血紅素和葉綠素，合成了血紅素1931Warburg德國發(fā)現(xiàn)呼吸酶及作用方式1937Haworth英國用透視式（Haworth式）表示單糖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)1937Kuhn，Karrer瑞士測定了VB2的結(jié)構(gòu)，闡明了VB2 與輔酶的關(guān)系1938Riehard Kuhn德國研究類胡蘿卜素和維生素1939Butenandt德國發(fā)現(xiàn)了性激素1939Domagk德國發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物的抗菌作用1943HevesyDamDoisy匈牙利丹麥美國用同位素示蹤法研究化學(xué)反應(yīng)過程發(fā)現(xiàn)維生素K的化學(xué)性質(zhì)1945FlemingFlorey英國澳大利亞發(fā)現(xiàn)青霉素及其在治療各種傳染病中效果

12、1946Sumner美國分離和提純了結(jié)晶蛋白酶1947Robinson英國研究生物堿和其它植物制品1947C.F.CoriG.T.Cori美國美國發(fā)現(xiàn)糖代謝中的酶促反應(yīng)1948Tiselius瑞典發(fā)明了電泳技術(shù)并發(fā)現(xiàn)血清蛋白的組分1950KendallHenchReichstein美國美國瑞士發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)激素及其結(jié)構(gòu)和生理效應(yīng)1952Martin英國發(fā)明了分配色譜技術(shù)1952Waksman美國發(fā)現(xiàn)鏈霉素1953Lipmann，Krebs英國發(fā)現(xiàn)輔酶A/發(fā)現(xiàn)克雷布斯循環(huán)（三羧酸循環(huán)）1954Linus Pauling美國研究化學(xué)鍵的本質(zhì)，發(fā)現(xiàn)螺旋1955Vigneaud美國發(fā)現(xiàn)了生物化學(xué)中的重

13、要含硫化合物，合成了多肽激素1955Theorell瑞典發(fā)現(xiàn)了過氧化酶的性質(zhì)和作用方式1957Todd英國闡明了核苷酸和核苷酸輔酶的關(guān)系1958Sanger英國闡明了胰島素的一級結(jié)構(gòu)1959KornbergOchoa美國美國在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶1970Leloir阿根廷發(fā)現(xiàn)核苷酸及其在碳水化合物合成中的作用1971Sutherland美國發(fā)現(xiàn)了cAMP 及作為第二信使的作用1972AnfinsenMooreStein美國美國美國研究酶化學(xué)的基本理論1972EdelmanPorter美國英國測定了抗體蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)1975Cornforth英國研究有機(jī)分子和酶催化反應(yīng)的立體化學(xué)19

14、77GuilleminSchallyYalow美國美國美國發(fā)現(xiàn)大腦分泌的多肽類激素提出多肽類激素的放射免疫分析法1978Mitchell英國提出化學(xué)滲透學(xué)說以解釋氧化磷酸化的作用機(jī)制1978ArberNathansSmith瑞士美國美國發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶以及在分子遺傳學(xué)方面的應(yīng)用1980SangerGilbert英國美國建立DNA雙脫氧鏈中止法測序建立DNA化學(xué)法測序1982Klug英國以電子顯微鏡和X射線衍射法研究核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體1983McClintock美國發(fā)現(xiàn)可移動的基因1984Merifield美國研究多肽的合成1985BrownGoldstein美國美國關(guān)于膽固醇代謝調(diào)控的研究19

15、86CohenMontalcini美國意大利發(fā)現(xiàn)生長因子1987 Pedersen美國合成能模擬重要生物過程的有機(jī)化合物，為超分子化學(xué)奠定基礎(chǔ)1988HuberDeisehoferMichel德國德國德國確定了光合作用反應(yīng)中心的立體結(jié)構(gòu)1989CechAltman美國發(fā)現(xiàn)了核酶，即核糖核酸具有酶的催化功能1992Fischer美國發(fā)現(xiàn)酶磷酸化和去磷酸化的調(diào)控作用1993MullisSmith美國加拿大發(fā)明多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)提出寡聚核苷酸定點(diǎn)突變1993RobertsSharp美國美國發(fā)現(xiàn)斷裂基因1994GilmanRodbell美國美國發(fā)現(xiàn)G蛋白1997Prusiner美國發(fā)現(xiàn)朊病毒

16、1997SkouWalkerBoyer丹麥英國美國發(fā)現(xiàn)ATP合成的分子機(jī)制2002Wiithrich田中耕一Fenn瑞士日本美國用核磁共振(NMR)檢測生物大分子的結(jié)構(gòu)2004Aaron Ciechanover Avram HershkoIrwin Rose以色列以色列美國發(fā)現(xiàn)泛素調(diào)控的蛋白質(zhì)降解2006FireMello美國美國發(fā)現(xiàn)了RNA干擾機(jī)制2008錢永健ChalfieOsamu Shimomura美籍華裔美國美籍日裔發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白(GFP)我國生物化學(xué)界的主要成就 我國生物化學(xué)界的先驅(qū)吳憲教授在20年代初由美回國后，在協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生化系與汪猷、張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理

17、論、血液生化檢測和免疫化學(xué)等一系列有重大影響的研究。 1965年我國用化學(xué)方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，1983年又通過大協(xié)作完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工合成。近年來，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物膜的結(jié)構(gòu)與功能等方面都有舉世矚目的研究成果。 90年代以來，我國參與了人類基因組計(jì)劃，在水稻基因組研究中處于國際領(lǐng)先水平，在功能基因組學(xué)研究中也取得不少成績。6 學(xué)習(xí)方法 （1）要有良好的精神狀態(tài)。生物化學(xué)與分子生物學(xué)內(nèi)容復(fù)雜而且抽象，學(xué)生學(xué)習(xí)時(shí)容易產(chǎn)生畏難情緒，積極培養(yǎng)學(xué)習(xí)的興趣，以良好的精神狀態(tài)進(jìn)行學(xué)習(xí)，才能有好的學(xué)習(xí)效果。 （2）要注意記憶與理解的相互促進(jìn)。生物化學(xué)

18、與分子生物學(xué)內(nèi)容十分豐富，有不少知識點(diǎn)需要記憶，豐富的記憶材料是良好理解能力的基礎(chǔ)，對問題的理解又可以促進(jìn)記憶，學(xué)生在學(xué)習(xí)中應(yīng)注意鍛煉記憶與理解的相互促進(jìn)的學(xué)習(xí)方法。 （3）要注重閱讀和練習(xí)。生物化學(xué)與分子生物學(xué)的有些內(nèi)容特別復(fù)雜，學(xué)生讀一本書或聽一次課有時(shí)對問題的理解不深，如果能讀多本書，不同的書敘述問題的角度不同，有助于學(xué)生加強(qiáng)對問題的理解。這門課有不少內(nèi)容需要用化學(xué)的理論進(jìn)行一定的計(jì)算，還有一些內(nèi)容需要用實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象來分析一定的問題，這就需要學(xué)生通過作業(yè)來練習(xí)。因此，加強(qiáng)閱讀和練習(xí)至關(guān)重要。 （4）注重學(xué)習(xí)科學(xué)思維的方法和實(shí)驗(yàn)技能。生物化學(xué)與分子生物學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)學(xué)科，絕大部分知識和理論都是通

19、過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的，了解重要科學(xué)發(fā)現(xiàn)的思路和主要途徑，對于培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)思維的能力和創(chuàng)新能力十分重要。本課程的教學(xué)過程中將會介紹一些相關(guān)的內(nèi)容，希望引起同學(xué)的足夠重視。實(shí)驗(yàn)技能對于獲取新知識十分重要，一定要給與足夠的關(guān)注，閱讀相關(guān)的書籍，進(jìn)行必要的實(shí)驗(yàn)技能訓(xùn)練。 （5）注重與數(shù)理化特別是化學(xué)知識的聯(lián)系。生物化學(xué)與分子生物學(xué)是以數(shù)理化特別是化學(xué)為基礎(chǔ)的。用化學(xué)理論來探索生物體的物質(zhì)組成、有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)和代謝、與此相關(guān)的研究方法，構(gòu)成了生物化學(xué)與分子生物學(xué)的基本內(nèi)容，因此，學(xué)習(xí)生物化學(xué)與分子生物學(xué)一定要有很好的化學(xué)基礎(chǔ)。數(shù)學(xué)、物理學(xué)和信息科學(xué)為生物化學(xué)與分子生物學(xué)提供研究思路和手段，生物化學(xué)與分子生物學(xué)的

20、許多重大突破是由化學(xué)家和物理學(xué)家完成的，從一個(gè)側(cè)面說明了數(shù)理化對于生物化學(xué)與分子生物學(xué)十分重要。 （6）注重與生物學(xué)功能的聯(lián)系。生物化學(xué)與分子生物學(xué)是以生物體為研究對象的，對生物學(xué)的基本知識了解越多，學(xué)習(xí)生物化學(xué)與分子生物學(xué)就越容易，生物體內(nèi)的物質(zhì)組成、組成物質(zhì)的性質(zhì)、代謝和調(diào)控都是與其生物學(xué)功能相適應(yīng)的。因此，從生物學(xué)功能的角度理解問題，可以顯著的提高學(xué)習(xí)的效率。 參考書1.王鏡巖等. 生物化學(xué). 高等教育出版社, 2002, 第3版.(260萬字)2.王鏡巖等. 生物化學(xué)教程. 高等教育出版社, 2008. (140萬字)3.張麗萍, 楊建雄. 生物化學(xué)簡明教程, 高等教育出版社, 200

21、9, 第4版. (69萬字)4.鄭集, 陳均輝.普通生物化學(xué), 高等教育出版社,2007,第4版.(130萬字)5.楊榮武. 生物化學(xué)原理. 高等教育出版社, 2006. (180萬字)6. David L, Nelson and Michael M.Cox, Lehninger Principles of Biochemistry. W H Freeman & Co Publishers,2004 (Fourth dition). 周海夢等譯, 第3版中譯本, 2005, 高等教育出版社.7.黃熙泰, 于自然, 李翠鳳. 現(xiàn)代生物化學(xué). 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005, 第2版.(85.8萬字)

22、8.Garrett, and Grisham, Biochemistry(第3版, 影印版). 2005, 高等教育出版社.9.張楚富. 生物化學(xué)原理. 高等教育出版社, 2003. (108萬字)10.周愛儒, 查錫良. 生物化學(xué). 人民衛(wèi)生出版社, 2006, 第6版.11.賈弘禔, 屈伸. 生物化學(xué)(七年制)，人民衛(wèi)生出版社, 2006, 第6版.12. 楊建雄. 分子生物學(xué), 化學(xué)工業(yè)出版社, 2009, 第1版.13.朱玉賢, 李毅. 現(xiàn)代分子生物學(xué), 高等教育出版社, 2008, 第3版.14.楊榮武. 分子生物學(xué), 南京大學(xué)出版社, 2007, 第1版.15.王曼瑩. 分子生物學(xué)

23、, 科學(xué)出版社, 2006, 第1版.16.趙亞華. 分子生物學(xué)教程, 科學(xué)出版社, 2006, 第2版. 17. 楊岐生. 分子生物學(xué), 浙江大學(xué)出版社, 2004, 第1版. 18. Benjemin Lewin,Genes , Pearson Education,Inc,2004. 趙壽元譯.科學(xué)出版社,2007,第1版. 19. 本杰明.盧因著,趙壽元譯,基因精要,科學(xué)出版社,2007,第1版. 20. James D.Watson et al. Molecular biologe of the gene 5thed., Benjemin Cummings, 2004. 楊煥民等譯.科

24、學(xué)出版社,2005.21. Robert F.Weaver,Molecular biology 3thed.,McGraw-Hill Companies, 2004. 2thed. 影印版,科學(xué)出版社,2001. 22. 楊建雄. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程, 2009, 科學(xué)出 版社,第2版.23. 趙永芳.生物化學(xué)技術(shù)原理與應(yīng)用,科學(xué)出版社,2008,第4版.24. 郭靄光, 郭澤坤. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù). 高等教育出版社, 2007.25. 黃德娟, 徐曉暉. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程. 華東理工大學(xué)出版社, 2007, 第1版.26. 屈伸, 劉志國. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù). 化學(xué)工業(yè)出版社

25、, 2008.27. 趙亞力等. 分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)教程. 清華大學(xué)出版社, 2006.28. 奧斯伯等. 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南, 第4版. 馬學(xué)軍譯. 科學(xué) 出版社, 2005, 29. 薩姆布魯克等. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南. 第3版. 黃培堂譯. 科學(xué)出 版社, 2002, 30. 楊建雄. 生物化學(xué)學(xué)習(xí)指導(dǎo)與習(xí)題詳解, 陜西師范大學(xué)出版 社, 2005.31. 張楚富.生物化學(xué)解題指導(dǎo)與測驗(yàn), 高等教育出版社, 2004.32. 陳鈞輝等. 生物化學(xué)習(xí)題解析, 科學(xué)出版社, 2002, 第2版.第一章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)中的定量分析第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理 （一）測量誤差 任何測量都是測量

26、者通過某種儀器進(jìn)行的。由于受分析方法、測量儀器、試劑和分析工作者的主觀因素等方面的限制，得到的測量結(jié)果不可能和真實(shí)值完全一致。在一定條件下，測量結(jié)果只能接近真實(shí)值，而不能達(dá)到真實(shí)值。 進(jìn)行定量分析時(shí)，必須根據(jù)對結(jié)果準(zhǔn)確度的要求，合理的安排實(shí)驗(yàn)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性做出合理判斷并予以正確表達(dá)。 誤差的大小是衡量一個(gè)測量值不準(zhǔn)確性的尺度。誤差越小，說明測量的準(zhǔn)確性越高。 測量中的誤差，可以用兩種方法表示。1. 絕對誤差 絕對誤差（absolute error）是測量值與真實(shí)值之差。 = x (：絕對誤差；x：測量值；：真實(shí)值） 絕對誤差以測量值的單位為單位，可以是正值，也可以是負(fù)值。測量值越接近真實(shí)

27、值，絕對誤差越小。 真實(shí)值是一個(gè)可以接近而不可達(dá)到的理論值。上式可以寫成： = x 說明在已知絕對誤差值的情況下，真實(shí)值可以從測定值減去絕對誤差而求得。2. 相對誤差（relative error）： 為了反映誤差在測量結(jié)果中所占的比例，分析工作中經(jīng)常使用相對誤差。相對誤差是以真實(shí)值的大小為基礎(chǔ)表示的誤差值，沒有單位。通常以%， 或 ppm表示。 /= (x -)/ 例如：測定純NaCl中Cl的百分含量為60.52%，而其真實(shí)含量（理論值）為60.66%。則 絕對誤差 = 60.52% 60.66% = 0.14% 如果不知道真實(shí)值，而知道絕對誤差值，則相對誤差也可以表示為： 例如：用分析天平

28、稱兩個(gè)重量，一個(gè)是2.1750g，另一個(gè)是0. 2715g，兩個(gè)重量的絕對誤差都是0.0001g，可是相對誤差卻大不相同， 一個(gè)是 另一個(gè)是 可見，由于兩個(gè)被測組分含量高低不同，即使絕對誤差相同，相對誤差也不同。對高含量組分測定的相對誤差應(yīng)當(dāng)要求小些，低含量組分測定的相對誤差要求允許大些。 例如：用重量法和滴定法測量樣品主要成分，相對誤差需要達(dá)到千分之一，而用比色法測定樣品中的微量成分時(shí)，相對誤差只要求達(dá)到百分之幾即可。（二）系統(tǒng)誤差 系統(tǒng)誤差（systematic error）也叫“可定誤差”，是由某種確定的原因引起的，一般有固定的方向（正或負(fù)）和大小，重復(fù)測定時(shí)重復(fù)出現(xiàn)。根據(jù)系統(tǒng)誤差的來源

29、，可分為：1. 方法誤差 方法誤差是由于不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或所選方法不恰當(dāng)所引起的，通常影響較大。比如：滴定分析中終點(diǎn)與化學(xué)計(jì)量點(diǎn)不相符合、重量分析中沉淀的溶解度過大或有共沉淀等，都會產(chǎn)生誤差。2. 儀器或試劑誤差 是由于儀器未經(jīng)校準(zhǔn)或試劑不合規(guī)格引起的。例 如：天平砝碼不準(zhǔn)、容量儀器刻度不準(zhǔn)或試劑不純等，均能產(chǎn)生這種誤差。3. 操作誤差 操作誤差是由于分析者操作不符合要求引起的。 例如：分析者對滴定終點(diǎn)顏色改變的判斷能力不夠高，總是偏深或偏淺，便會產(chǎn)生誤差。 由于系統(tǒng)誤差是重復(fù)的以固定方向和大小出現(xiàn)，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行測定次數(shù)的方法消除。（三）隨機(jī)誤差（accid

30、ental error ): 也稱偶然誤差，是由于偶然的原因，如測量條件、實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度等變動而未能得到控制的條件波動引起的，其大小和正負(fù)都不固定。 偶然誤差的出現(xiàn)看起來似乎沒有規(guī)律，但多次測量就會發(fā)現(xiàn)絕對值相同的正負(fù)偶然誤差出現(xiàn)的概率大致相等，它們之間能完全或部分抵消。因此通過增加平行測定次數(shù)，就可以減免測定結(jié)果中這種誤差。也可以通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估計(jì)出偶然誤差值，并在測定結(jié)果中予以正確表達(dá)。 系統(tǒng)誤差和偶然誤差往往不能區(qū)分。比如：在觀察滴定終點(diǎn)的顏色變化時(shí)，有人總是偏深，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。但多次測定中偏深程度不一樣，又必然有偶然誤差。二、準(zhǔn)確度和精密度1. 準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度（accuracy）表示

31、分析結(jié)果與真實(shí)值接近的程度。準(zhǔn)確度的大小，用誤差表示。誤差越大，準(zhǔn)確度越低。2. 精密度 精密度（precision）表示平行測量的各測量值之間的相互接近程度，表示測量的重現(xiàn)性，用以下幾個(gè)指標(biāo)表示。（1）偏差 由于真實(shí)值通常是不知道的，因此在實(shí)際工作中無法求出數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，只得用精密度來評價(jià)分析的結(jié)果。一般用偏差來衡量分析結(jié)果的精密度，偏差也有絕對偏差和相對偏差兩種表示方法。 設(shè)n次平行測定得到的數(shù)據(jù)為x1，x2，xn，其算術(shù)平均值為： 絕對偏差 = 測定值 算術(shù)平均值（不計(jì)正負(fù)號），即： 當(dāng)然，與誤差的表示方法一樣，用相對偏差來表示實(shí)驗(yàn)的精確度，比用絕對偏差更有意義。此外，精密度也常用平均絕

32、對偏差和平均相對偏差來表示。平均絕對偏差是個(gè)別測定值的絕對偏差的算術(shù)平均值，平均相對偏差是個(gè)別測定值的相對偏差的算術(shù)平均值。即： 統(tǒng)計(jì)學(xué)常用的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別可定義為： 應(yīng)該指出，準(zhǔn)確度和精確度、誤差和偏差具有不同的含義，不能混為一談。準(zhǔn)確度是表示測定值與真實(shí)值相符合的程度，用誤差來衡量，誤差越小，準(zhǔn)確度愈高。精確度則表示在相同條件下多次重復(fù)測定值相符合的程度，用偏差來衡量，偏差愈小，精確度愈好。誤差以真實(shí)值為標(biāo)準(zhǔn)，而偏差以平均值為標(biāo)準(zhǔn)，由于物質(zhì)的真實(shí)值一般是無法知道的，我們平時(shí)所說的真實(shí)值其實(shí)只是采用各種方法進(jìn)行多次平行分析所得到相對正確的平均值。用這一平均值代替

33、真實(shí)值來計(jì)算誤差，得到的結(jié)果仍然只是偏差。 還應(yīng)指出，用精確度來評價(jià)分析的結(jié)果是有一定局限性的。分析結(jié)果的精確度很高（即平均相對誤差很小），并不一定說明實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度也很高。因?yàn)槿绻治鲞^程中存在系統(tǒng)誤差，可能并不影響每次測得數(shù)值之間的重合程度，即不影響精確度，但此分析結(jié)果卻偏離真實(shí)值，也就是分析的準(zhǔn)確度并不一定很高。當(dāng)然，如果精確度不高，則無準(zhǔn)確度可言。所以，精確度是保證準(zhǔn)確度的先決條件。在實(shí)際分析中，首先要求良好的精確度，測定的精確度越好，得到準(zhǔn)確結(jié)果的可能性就越大，通常進(jìn)行分析時(shí)，對同一試樣，必須用同樣方法，在同一條件下由同一個(gè)人操作，作幾個(gè)平行測定，取其平均值，測定次數(shù)越多，平均值就越接

34、近真實(shí)值。 三、提高分析準(zhǔn)確度的方法1. 選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒?不同方法的準(zhǔn)確度和靈敏度不同，一般來說，測定常量成分的方法不要求太大的靈敏度。如重量分析法和容量分析法靈敏度雖然不高，但對常量組分的測定可以獲得比較準(zhǔn)確的結(jié)果，一般相對誤差不超過千分之幾。但對于微量和痕量組分的分析，常常測不出來，談不上精確度。儀器分析法靈敏度很高，測定常量組分要高度稀釋后，從樣品中取一小部分進(jìn)行測定，其結(jié)果無法準(zhǔn)確。測定微量和痕量組分盡管相對誤差較大，但絕對誤差不大，能符合準(zhǔn)確度的要求。 總之，必須根據(jù)分析對象，樣品情況以及對分析結(jié)果的要求，選擇恰當(dāng)?shù)姆治龇椒ā?. 減少偶然誤差的措施 （1）平均取樣 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求

35、并考慮生物材料的特殊性如動物的種屬、年齡、性別、生長狀態(tài)及飼養(yǎng)條件，選取動、植物某一新鮮組織制成勻漿后取樣，細(xì)菌通常制成懸浮液，經(jīng)玻璃珠打散搖勻后，再量取一定體積的菌體樣品。固體樣品應(yīng)于取樣前先進(jìn)行粉碎，混勻。 （2）做平行實(shí)驗(yàn) 根據(jù)偶然誤差出現(xiàn)的規(guī)律，做平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算測定量的平均值，可以有效地減少偶然誤差。需要強(qiáng)調(diào)的是，不可將對分析儀器的重復(fù)讀數(shù)看作平行實(shí)驗(yàn)。如用分光光度法做平行實(shí)驗(yàn)，必須從樣品制備和顯色反應(yīng)起做平行實(shí)驗(yàn)，才有可能減少樣品稱量和加各種試劑時(shí)造成的偶然誤差。對比色杯中同一個(gè)溶液多次讀數(shù)，只能減少儀器本身造成的偶然誤差，對高質(zhì)量和高精度的儀器來說，這樣的操作沒有意義的。 除去以上

36、兩類誤差之外，還有因分析人員工作中的粗心大意、操作不正確引起的“過失誤差”，如讀錯(cuò)刻度讀數(shù)，溶液濺出，加錯(cuò)試劑等，這時(shí)可能出現(xiàn)一個(gè)很大的“誤差值”，在計(jì)算算術(shù)平均值時(shí)，應(yīng)舍去此種數(shù)值。3. 減少系統(tǒng)誤差的措施 （1）設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)物對照 在任何測試中，甚至在使用標(biāo)定儀器和基準(zhǔn)試劑時(shí)，都應(yīng)使用待測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢查方法的準(zhǔn)確度。標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)與待測溶液用完全相同的方法處理，可以畫出一條以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，測定值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從待測溶液得到的測定值應(yīng)落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，能夠從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出測定數(shù)值相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)物的量?；蛘呷?biāo)準(zhǔn)物某一確定濃度的溶液與待測液以同樣的方法，在相同條件下測定（標(biāo)準(zhǔn)物的組成

37、最好與待測液相似，含量也相近），得平均值 標(biāo)準(zhǔn)物的已知濃度常視為真實(shí)值，用t-檢驗(yàn)法（參閱統(tǒng)計(jì)學(xué)著作）檢驗(yàn) 與之間是否有顯著性差異，即檢驗(yàn)所采用的測定方法是否有系統(tǒng)誤差。如果有系統(tǒng)誤差，需對待測液的測定值加以校正。計(jì)算方法如下： 則 式中，為待測液測定值的平均值，作為校正系數(shù)。測定值經(jīng)校正后，即可消除測定中的系統(tǒng)誤差。 （2）設(shè)置空白試驗(yàn) 在任何測量實(shí)驗(yàn)中，都應(yīng)設(shè)置空白溶液作為對照，以消除由于試劑中的干擾雜質(zhì)或溶液對器皿的侵蝕等所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。用等體積的去離子水代替待測液，并嚴(yán)格按照待測液和標(biāo)準(zhǔn)液相同的方法及條件同時(shí)進(jìn)行平行測定，所得結(jié)果稱為空白值，它是由所用的試劑而不是待測物所造成的。將待

38、測物的分析結(jié)果扣除空白值，就可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。空白值一般不應(yīng)過大，特別在微量分析測定時(shí)，如果空白值太大，應(yīng)將試劑加以純化和改用其他適當(dāng)?shù)钠髅蟆?（3）校正儀器 儀器不準(zhǔn)確引起的系統(tǒng)誤差，可以通過對儀器的校正來減小。為此，應(yīng)該經(jīng)常對測量儀器（如砝碼、天平、容器等）進(jìn)行校正，以減小誤差，并在計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)使用校正值。 總之，在分析測定工作中，應(yīng)注意合理安排實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，以盡量減少系統(tǒng)誤差或使系統(tǒng)誤差在測定中不起主要作用。四、有效數(shù)字及其運(yùn)算規(guī)則 反復(fù)測量某一個(gè)量所得到的數(shù)字，常由可靠數(shù)字和欠準(zhǔn)數(shù)字組成，如3次稱量某基準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果是：4.0843，4.0842合4.0844，前4位是可靠數(shù)字，第5

39、位是欠準(zhǔn)數(shù)字。分析工作中實(shí)際測到的數(shù)字，允許最后一個(gè)數(shù)字是可疑數(shù)。由可靠數(shù)字和最后一位欠準(zhǔn)數(shù)字（只能是一位，不能再多）組成的數(shù)字稱有效數(shù)字（significant figure），有效數(shù)字反映測量值的準(zhǔn)確度，要與測量的方法相適應(yīng)。 處于大于0的數(shù)字之前的0是用于定位的無效數(shù)字，處于大于0的數(shù)字之后的0則是有效數(shù)字，如0.0520的有效數(shù)字只有3位，5前面的2個(gè)0是用于定位的無效數(shù)字，2后面的0為有效數(shù)字。 有效數(shù)字進(jìn)行加減運(yùn)算時(shí)，所得結(jié)果的有效數(shù)字的位數(shù)由各測量值最大欠準(zhǔn)數(shù)字確定，如13.72 + 0.3628的和為14.08，由于13.72小數(shù)點(diǎn)后的第二位是欠準(zhǔn)數(shù)字，0.3628小數(shù)點(diǎn)后的第

40、三位和第四位再準(zhǔn)確都是沒意義的。 有效數(shù)字進(jìn)行乘除運(yùn)算時(shí)，積和商的相對誤差應(yīng)與因數(shù)中最大的相對誤差相當(dāng)。一般來說，有效數(shù)字的位數(shù)，應(yīng)與測量值中位數(shù)最少的數(shù)字相同。如0.159.6876的正確結(jié)果是1.5，而不應(yīng)寫作1.45314。但如果位數(shù)最少的因數(shù)首位是8或9，而積和商的首位不是8或9，則積和商的位數(shù)可以比有效數(shù)字最少的因數(shù)多一位。如0.91.236.1 = 39，而0.99 = 8。 有效數(shù)字的修約原則是四舍六入五成雙，如23.4550.546修約為23.460.55，而28.4450.675修約為28.440.68。 為了避免在有效數(shù)字運(yùn)算過程中偶然出現(xiàn)的連續(xù)舍4，或連續(xù)進(jìn)6影響最后結(jié)果

41、，一般在運(yùn)算過程中，將數(shù)據(jù)修約到比最后結(jié)果的位數(shù)多一位，一直到最后的計(jì)算結(jié)果，再修約到預(yù)定的位數(shù)。 在一般的科技文獻(xiàn)中，有效數(shù)字的位數(shù)為34位，太多的位數(shù)是多余的，甚至是虛假的。如將稱量數(shù)據(jù)寫作3658.2543 0.0058 g，就是不真實(shí)的，原因是可稱量3658 g的稱量用具精密度不可能達(dá)到 0.0001 g。 五、實(shí)驗(yàn)記錄 （1）實(shí)驗(yàn)前要弄清原理和操作方法，記錄實(shí)驗(yàn)條件，如生物材料來源、形態(tài)特征、健康狀況、選用的組織及其質(zhì)量，主要儀器的型號和規(guī)格，化學(xué)試劑的規(guī)格和準(zhǔn)確濃度等，以便總結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行核對和作為查找成敗原因的依據(jù)。 （2）在實(shí)驗(yàn)記錄本上寫出扼要的操作步驟（可用流程圖表示），和記錄

42、數(shù)據(jù)的表格等。在已設(shè)計(jì)好的記錄表格上，準(zhǔn)確記錄觀測數(shù)據(jù)，如稱量物的質(zhì)量、分光光度計(jì)的讀數(shù)等，并根據(jù)儀器的精確度準(zhǔn)確記錄有效數(shù)字。例如，吸光值為0.050，不應(yīng)寫成0.05。 （3）完成某一個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)后，應(yīng)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的計(jì)算，評價(jià)實(shí)驗(yàn)的成敗。如果懷疑所記錄的結(jié)果，或?qū)嶒?yàn)記錄有遺漏和丟失，都必須重做實(shí)驗(yàn)，絕對不能拼湊實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理和表達(dá) 要對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的的整理和計(jì)算，一般用圖表的形式概括實(shí)驗(yàn)的結(jié)果?？筛鶕?jù)所記錄數(shù)據(jù)的狀況，確定用圖還是用表。1. 表格 表格設(shè)計(jì)要緊湊、簡明并有編號和標(biāo)題，有時(shí)還需要在標(biāo)題下面或表格下面標(biāo)注詳細(xì)的說明。表格中的數(shù)據(jù)要有單位，若所有數(shù)據(jù)的單位是

43、一致的，可將單位標(biāo)注在標(biāo)題后的括號內(nèi)，若各行或各列的單位不同，可將單位列在每一列頂端的第一行，或每一行左端的第一列，而不要在表格的每一行中都重復(fù)地書寫數(shù)據(jù)的單位。表格中的數(shù)據(jù)應(yīng)有合適的位數(shù)，為此可適當(dāng)調(diào)整數(shù)據(jù)的計(jì)量單位，例如濃度0.00832 mol/L最好表示為8.32 mmol/L。經(jīng)多次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，要通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在表格中用列出數(shù)據(jù)。 2. 圖示（1）圖解 在實(shí)驗(yàn)報(bào)告或科研論文中，常常需要畫上專用儀器的粗略草圖，用圖線表示層析或電泳的結(jié)果，或用流程圖表示純化的步驟。繪制層析、電泳圖譜時(shí)，除比例關(guān)系可酌情安排外，層析斑點(diǎn)、電泳區(qū)帶形狀、位置、顏色及其深度、背景顏色等一定要與原

44、始記錄一致。近年來薄層層析斑點(diǎn)和電泳條帶多用照片或掃描圖譜，柱層析的洗脫曲線多用從管理系統(tǒng)的電腦直接采集的圖譜。（2）直線圖、折線圖和柱形圖有些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)存在線性關(guān)系，如y和x的關(guān)系符合方程式 則以y對x作圖就得到一條直線，直線的斜率是m，y軸的截距為c。有時(shí)y和x并不是線性關(guān)系，但對數(shù)據(jù)進(jìn)行某種處理，仍可得到一條直線，如Lambert-Beer定律和米氏方程方程的雙倒數(shù)作圖。近年來有線性關(guān)系的數(shù)據(jù)常用計(jì)算機(jī)直接得出線性回歸方程，實(shí)驗(yàn)報(bào)告或科研論文中很少再用直線圖了。 有些無線性關(guān)系的數(shù)據(jù)可用折線圖或柱形圖，畫圖時(shí)，習(xí)慣把自變量（已知量）畫在橫軸（x軸）上，而把因變量（測量值）畫在縱軸（y軸）上

45、。圖應(yīng)有簡明的標(biāo)題，清楚地標(biāo)明兩個(gè)軸的計(jì)量單位。要適當(dāng)調(diào)整數(shù)據(jù)的計(jì)量單位，用簡單數(shù)字標(biāo)明軸上的標(biāo)度，如使用10 mmol/L就比0.01 mol/L或10000 mol/L好。 折線圖的測量點(diǎn)要用清晰的符號標(biāo)出，符號的大小應(yīng)能指示各值的誤差。通過調(diào)整標(biāo)度盡可能使橫坐標(biāo)上各點(diǎn)間有合適的距離，不要使各點(diǎn)擠在一起或距離太大?？梢愿鶕?jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，用連續(xù)的曲線或折線連接各點(diǎn)。 蘆丁和BHT對O2-的清除作用 (meanSD, n = 3) 柱形圖將測量值表示為與橫軸垂直的線或棒，其長度表示因變量的大小。在橫軸的同一個(gè)刻度處可以有多個(gè)柱形圖標(biāo)，各個(gè)柱形圖標(biāo)要有容易區(qū)分的標(biāo)識，如橫線、豎線、斜線、不同的

46、顏色等。 在折線圖和柱形圖中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差一般在測量點(diǎn)的符號處用平行于縱軸的豎線標(biāo)出，豎線的長度表示標(biāo)準(zhǔn)差的大小。 蘆丁和綠原酸對O2-清除能力的比較 第二節(jié) 紫外可見分光光度法一、基本原理（一）Beer-Lambert 定律 當(dāng)一束單色光通過溶液時(shí)，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就會減弱。設(shè)入射光的強(qiáng)度為I0，透過濃度為c，液層厚度為b的溶液后，透射光的強(qiáng)度I必定小于I0，隨濃度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的強(qiáng)度則減小。透射光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值，稱為透光度(transmittance)，以T表示。 實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)液層厚度b和溶液濃度c按算術(shù)級數(shù)增加時(shí)，透光度T按幾何級

47、數(shù)減小，數(shù)學(xué)式為： A：吸光度，又稱光密度“O.D”； T：透光度， TI / I。； a：吸光系數(shù)（Lmol1cm1）； b：樣品光程（cm），常用1.0cm 的吸收池，則b = 1cm； c：樣品濃度（mol/L）。 當(dāng)a、c一定時(shí)，吸光度A與液層厚度b成正比，稱為朗伯定律(Lamberts law)。當(dāng)a、b一定時(shí)，吸光度A與溶液濃度c成正比，稱為比爾定律(Beers law)。 吸光度與液層厚度和溶液濃度的乘積成正比，稱為朗伯-比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為： A = abc 式中的a為比例常數(shù)，稱吸光系數(shù)，有兩種表示方式： 1. 摩爾吸光系數(shù)，是指在一定波長時(shí)

48、，溶液濃度為1mol/L，厚度為1cm的吸光度，用或EM表示。 2. 百分吸光系數(shù)或稱比吸光系數(shù)，是指在一定波長時(shí)，溶液濃度為1%(W/V)，厚度為1cm的吸光度，用E1%1cm表示。 吸光系數(shù)兩種表示方式之間的關(guān)系是： 摩爾吸光系數(shù)是物質(zhì)對某波長的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測定的靈敏度就越高。值大，說明電子躍遷的幾率大，通常 10105：一般認(rèn)為 104為強(qiáng)吸收；103104 為較強(qiáng)吸收； 102 為弱吸收，此時(shí)分光光度法不靈敏。 因?yàn)橥ǔＪ褂梅止夤舛扔?jì)可檢測出的最小吸光度A0.001, 所以，當(dāng)b1cm, 105時(shí)，可檢測的溶液最小濃度是C 10-8 mol

49、/L。 的值很難直接測定，通常要先測出 ，再按公式計(jì)算求得。 吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性： 即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。 若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測定 260nm的吸光度為0.650，用同一吸收池測定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，已知其摩爾吸光系數(shù) = 8.2103 M-1cm，計(jì)算其摩爾濃度。）。 A bC , A （溶劑加樣品的吸光度）（溶劑的吸光度） A 0.6500.070 0.580 b 1cm C = 0.580/(8.

50、2103) = 7.110-5 mol / L（二）影響吸光系數(shù)的因素 吸光系數(shù)的大小，取決于物質(zhì)(溶質(zhì)、溶劑)的本性和光的波長。 1. 物質(zhì)不同，則吸光系數(shù)不同。以吸光系數(shù)可作為物質(zhì)的特性常數(shù)。在分光光度法中，常用摩爾吸光系數(shù)來衡量顯色反應(yīng)的靈敏度，值越大，靈敏度越高。 2. 溶劑不同，其吸光系數(shù)亦不同。所以在說明某一物質(zhì)的吸光系數(shù)時(shí)，應(yīng)注明溶劑。 3. 光的波長不同，其吸光系數(shù)亦不同。如將不同波長的單色光依次通過被分析物質(zhì)，分別測得吸光度，然后繪制吸光度-波長曲線，稱為吸收曲線(absorption curve)，又稱吸收光譜(absorption spectrum)。由吸收曲線可以看出物

51、質(zhì)的吸收特征。吸收曲線上有極大值的部分，稱為吸收峰。吸收峰所對應(yīng)的波長，稱為最大吸收波長，以符號max表示 ，這是物質(zhì)定性的依據(jù)之一。物質(zhì)的定量也常選擇在max處測定其吸光度，因?yàn)樵诖颂帨y定的靈敏度最高。 4. 單色光的純度也影響吸光系數(shù)。單色光越純，即經(jīng)單色器分光后的波長范圍越窄，其吸光系數(shù)越大。嚴(yán)格說來，朗伯-比爾定律只有當(dāng)入射光是單色光時(shí)才完全適用，但實(shí)際上不管儀器中光學(xué)系統(tǒng)的質(zhì)量怎樣高，單色化以后的光還是具有一定的寬度，這取決于儀器的精確程度。濾光片的分光本領(lǐng)較差，故一般測得的吸光系數(shù)要比真值小得多。 二、分光光度計(jì)的主要部件1. 光源 理想光源的條件是：能提供連續(xù)的輻射；光強(qiáng)度足夠大

52、；在整個(gè)光譜區(qū)內(nèi)光譜強(qiáng)度不隨波長有明顯變化；光譜范圍寬；使用壽命長，價(jià)格低。 用于可見光和近紅外光區(qū)的光源是鎢燈，現(xiàn)在最常用的是鹵鎢燈（Halogen lamp），即石英鎢燈泡中充以鹵素，以提高鎢燈的壽命。適用波長范圍是3201100nm。由于能量輸出的波動為電壓波動的四次方倍，因此電源電壓必須穩(wěn)定。 用于紫外光區(qū)的是氘燈（Deuterium lamp），適用波長范圍是195400nm，由于氘燈壽命有限，國產(chǎn)氘燈壽命僅五百小時(shí)左右，要注意節(jié)約燈時(shí)。 2. 單色器 單色器是分光光度計(jì)的心臟部分，它的作用是把來自光源的混合光分解為單色光并能隨意改變波長。它的主要組成部件和作用是： 入射狹縫 限制雜

53、散光進(jìn)入。 色散元件 即棱鏡或光柵，是核心部件，可將混合光分解為單色光。 準(zhǔn)直鏡 把來自入射狹縫的光束轉(zhuǎn)化為平行光，并把來自色散元件的平行光聚焦于出射狹縫上。 出射狹縫 只讓額定波長的光射出單色器。 轉(zhuǎn)動棱鏡或光柵的波長盤，可以改變單色器出射光束的波長；調(diào)節(jié)出入射狹縫隙的寬度，可以改變出射光束的帶寬和單色光的純度。 3. 樣品室 包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各種可更換的附件。池架有普通池架和恒溫池架，恒溫池架有水恒溫池架和電恒溫池架。水恒溫池架需用循環(huán)水恒溫裝置打入循環(huán)水保持池架恒溫，控溫精度為 0.1，電恒溫池架十分昂貴，控溫精度可達(dá) 0.05。 吸收池有光學(xué)玻璃杯和石英玻璃杯兩種。

54、光學(xué)玻璃杯因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)玻璃吸收紫外光，因此只能用于可見光，適用波長范圍是400nm2000nm。石英玻璃杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm3000nm。 吸收池使用注意事項(xiàng)： 要徹底清洗，尤其是盛過蛋白質(zhì)等溶液，干后形成一層膜，不易洗去，通常杯子不用時(shí)可放在 1洗潔凈液中浸泡，去污效果好，使用時(shí)用水沖洗干凈，要求杯壁不掛水珠，還可以用綢布絲線或軟塑料制作一個(gè)小刷子清洗杯子。 嚴(yán)禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。嚴(yán)禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。 嚴(yán)禁加熱烘烤。急用干的杯子時(shí)，可用酒精蕩洗后用冷風(fēng)吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。4. 檢測

55、器 檢測器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，即把光強(qiáng)度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等三種。 光電管 光電管可檢測10微微安（10-11A）的光電流，管內(nèi)抽真空充入惰性氣體。 光電倍增管 它是檢測弱光的最靈敏最常用的光電元件，其靈敏度比光電管高200多倍，光電子由陰極到陽極重復(fù)發(fā)射9次以上，每一個(gè)光電子最后可產(chǎn)生106107個(gè)電子，因此總放大倍數(shù)可達(dá)106107倍，光電倍增管的響應(yīng)時(shí)間極短，能檢測10-810-9秒級的脈沖光。其靈敏度與光電管一樣受到暗電流的限制，暗電流主要來自陰極發(fā)射的熱電子和電極間的漏電。 光電二極管 其原理是這種硅二極管受紫外-近紅外輻射照射時(shí)，其導(dǎo)電性

56、增強(qiáng)的大小與光強(qiáng)成正比。近年來分光光度計(jì)使用光電二極管作檢測器在增加，雖然其靈敏度還趕不上光電倍增管，但它的穩(wěn)定性更好，使用壽命更長，價(jià)格便宜，因而許多著名品牌的高檔分光光度計(jì)都在使用它作檢測器。 5. 顯示裝置 低檔分光光度計(jì)現(xiàn)在已都使用數(shù)字顯示，有的還連有打印機(jī)。高性能分光光度計(jì)均可以連接微機(jī)，而且有的主機(jī)還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機(jī)和打印繪圖機(jī)，有的還帶有標(biāo)準(zhǔn)軟驅(qū)，存取數(shù)據(jù)更加方便。6.分光光度儀器的使用 分光光度計(jì)的種類和型號很多，操作界面和操作方法不盡相同，要仔細(xì)閱讀說明書，按說明書的要求操作儀器。不過，各類儀器的操作均可看作下列幾個(gè)步驟： 打開電源開關(guān)，預(yù)熱儀器。 選擇合

57、適的波長。 將待測溶液依次倒入比色池，達(dá)到2/3高度即可，透光面的外部要擦凈。 依次將比色池垂直放入比色池架，光路要通過透光面。 將對照管置于光路，進(jìn)行T調(diào)零和A調(diào)零。 依次讀取樣品管的數(shù)據(jù)。有多個(gè)樣品時(shí)，要保留對照管，其他比色池的樣品液可更換。 三、分光光度法的定性與定量方法（一）定性方法 一系列不同波長的單色光照射待測溶液，可測的一系列相應(yīng)的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖，可以得到待測物質(zhì)的吸收曲線。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較而定性。 實(shí)際工作中常用max 和來定性，max 可以從吸收曲線中吸收峰所對應(yīng)的波長直接找出； 通常需配置待測物質(zhì)三種不同濃度的溶液，在1cm的吸收池中，在max

58、處分別測定其吸光度，根據(jù)A= bc,即=A/bc，計(jì)算出，將三次結(jié)果平均，即是該物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)。從吸收光譜中初步推斷官能團(tuán) 一個(gè)化合物在220800nm范圍內(nèi)無吸收（1），它可能是脂肪族飽和碳?xì)浠衔?、醇、醚、羧酸、胺等，不含直鏈或環(huán)狀共軛體，沒有醛、酮等基團(tuán)。在210250nm有吸收帶，可能含量2個(gè)共軛單位，250300nm有弱吸收帶，表示有羰基存在。異構(gòu)體的推定 許多異構(gòu)體可以利用雙鍵位置不同，通過紫外吸收光譜推斷異構(gòu)體結(jié)構(gòu)?；衔锕羌艿耐贫?未知化合物與已知化合物的紫外吸收光譜一致時(shí)，可以認(rèn)定兩者具有同樣的發(fā)色團(tuán)。通過這個(gè)原理可以推定未知化合物的骨架。（二）定量方法 根據(jù)比爾定律，物

59、質(zhì)在一定波長處的吸光度與濃度之間有線性關(guān)系。因此，只要選擇一定的波長測定溶液的吸光度，即可求出濃度。1. 吸光系數(shù)法（絕對法） 根據(jù)比爾定律A = c l ，若 l 和吸光系數(shù)或E1%1cm已知，即可根據(jù)測得的A，求出被測物的濃度。 C = A / l 通?；駿1%1cm可以在手冊或文獻(xiàn)中查到。 示例見課本P10.2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 在有些情況下，如單色光不純等情況，測得的吸光值隨所用儀器不同而有相當(dāng)大的變化。若此時(shí)用吸光系數(shù)換算成濃度，將產(chǎn)生很大的誤差。 但如果只用一臺固定的儀器，則可認(rèn)定在固定的工作狀態(tài)和測定條件下，濃度與吸光度之間的關(guān)系在許多情況下是線性關(guān)系或接近于線性關(guān)系。 A = KC

60、(K只為比例常數(shù)，而非物質(zhì)常數(shù)） 依據(jù)上式的關(guān)系進(jìn)行定量是分光光度法中比較簡便易行的方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 （1）配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 （2）在測定條件相同的情況下，分別測定其吸光度。 （3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（不必考慮顯色劑等引起的濃度變化），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。 （4）在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。 如Folin酚試劑法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)含量 取14只試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(250 g/mL)，用水補(bǔ)足到1mL，加入5mL試劑甲，混勻，于2025放置10分