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1、第1頁實驗 二 乙酰丙酮顯色法測定血清甘油三酯鄭佳音第2頁實驗目的 掌握:掌握乙酰丙酮顯色法測定TG的原理熟悉: 抽提法抽提TG的多步驟操作過程第3頁【血漿脂蛋白結構】第4頁【血清TG測定方法概述】化學法用有機溶劑抽提標本中的TG,去除標本中的磷脂等干擾物后,用堿水解(皂化)TG為甘油,以過碘酸氧化甘油生成甲醛,然后用顯色反應測定甲醛。其中比較準確的是變色酸顯色法(Van-Handel法),比較簡便的是乙酰丙酮顯色法。酶法始于20世紀70年代初,80年代開始普及全酶法。曾經(jīng)應用過偶聯(lián)丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶的紫外分光光度法,甘油脫氫酶法,磷酸甘油氧化酶法,甘油磷酸脫氫酶法等多種。以GPO-PAP

2、法較為常用 。第5頁化學法基本步驟:1抽提 抽提的關鍵是選用合適的抽提劑,既要使甘油三酯提取完全,又要消除磷脂、游離甘油和葡萄糖等干擾物質的影響。用正壬烷、異丙醇和稀硫酸混合溶劑選擇性提取甘油三酯。抽提后,下層異丙醇中主要是化學極性大的磷脂和游離甘油,上層正壬烷中主要是甘油三酯,約占總量的99。正壬烷可以用正庚烷代替。第6頁化學法基本步驟:2.皂化 甘油三酯水解生成甘油,這一步大都采用KOH作皂化劑,溫度一般控制在5060,時間為515min。水解不完會影響測定結果。3.氧化 過碘酸在酸性溶液中將甘油氧化成甲醛和甲酸。由于這一反應并非甘油特有,凡含有相鄰的羥基或有相鄰的羥基和氨基的化合物,如-

3、磷酸甘油(磷脂的水解產物)、葡萄糖等都會引起干擾,故在第一步提取時應盡量除去這類物質。4. 顯色 甲醛與變色酸在硫酸溶液中加熱生成紫色化合物,吸收峰為570nm。該法靈敏度高,也較穩(wěn)定,線性范圍可達10mmol/L; 第7頁化學法基本步驟:甲醛與乙酰丙酮在銨離子(NH4+)存在下生成黃色的二乙酰二氫二甲基吡啶,吸收峰為412nm。(亦可用熒光法測定。)第8頁【方法學評價】目前TG測定尚無公認的參考方法,美國CDC將Van-Handel方法修改后作為內部參考方法。此法抽提完全,去除了磷脂與甘油干擾,以變色酸作顯色劑,具有靈敏度高,呈色穩(wěn)定等優(yōu)點,但操作步驟多,不適合于日常工作中應用?;瘜W法中比較

4、簡便且準確度高的方法是用異丙醇抽提,沸石合劑吸附磷脂,經(jīng)皂化與氧化后用乙酰丙酮顯色的修改LRC法。第9頁【實驗原理】 血清甘油三酯(triglyceride,TG)經(jīng)正庚烷-異丙醇抽提,然后用氫氧化鉀皂化,所生成的甘油再被過碘酸鈉氧化為甲醛,后者在銨離子存在下與乙酰丙酮反應,生成帶熒光的黃色物質即3,5-二乙酰-1,4-二氫二甲基吡啶(Hantgsch反應),顏色深淺與血清甘油三酯濃度成正比。與同樣處理的標準液比較,求得其含量。第10頁抽提劑:正庚烷與異丙醇以2:3.5體積混合,貯棕色瓶中.0.04mol/L硫酸:皂化劑:取KOH(AR)2.5g,加50ml蒸餾水溶解,加異丙醇500ml, 貯

5、棕色瓶中氧化劑:無水醋酸銨77g溶于蒸餾水中,加冰乙酸60ml,過碘酸1g,加蒸餾水至1升顯色劑:乙酰丙酮2ml加至異丙醇500ml,混勻,貯于棕色瓶內.甘油三酯校準品:1.15mmol/L【試劑與器材】 第11頁表2-3 乙酰丙酮顯色法測定甘油三酯加入物(ml) 空白管 標準管2 測定管2血清 0.2標準液 0.2 蒸餾水 0.2 - 抽提劑 2.5 2.5 2.540mmol/L H2SO4 0.4 0.4 0.4 邊加邊搖,使之充分混勻,靜置分層后,分別準確吸取上清液于另外3支試管中上清液 0.3 0.3 0.3皂化劑 1.0 1.0 1.0 充分混勻,65水浴3min 氧化劑 1.0

6、1.0 1.0顯色劑 1.0 1.0 1.0【操作步驟】 第12頁 充分混勻,65水浴15 min,取出冷卻5分鐘后比色,波長420mn,1cm比色皿比色,空白管調零.讀取各吸光度。操作提示:1.漩渦振蕩器上混勻抽提時要完全;2.吸取上清液(正庚烷層)時要小心,不能混有下層液體(異丙醇層);3.皂化、顯色的溫度、時間要一致(溫度和時間與吸光度有關)。第13頁【計算】標準管TG濃度第14頁【參考范圍】 正常人TG水平高低受生活條件的影響,我國人低于歐美人,成年以后隨年齡上升。TG水平的個體間差異比總膽固醇(TC)大,人群調查的數(shù)據(jù)比較分散,呈明顯正偏態(tài)分布。我國血脂異常防治建議提出的判斷標準:

7、TG 1.70mmol/L(150mg/dl)為理想范圍; TG 1.70mmol/L(150mg/dl)為升高。 第15頁【臨床意義】 1血清TG增高 2血清TG降低 第16頁【注意事項】1.黃疸、溶血對本試驗無影響,抗凝劑中肝素、EDTA-Na2和草酸鈉均無干擾,但檸檬酸鈉會使結果偏低。2.為了保證反應條件的一致性,應每次測定標準管以減少誤差。測定管A0.7時,標本宜減量重測。3.顯色在15分鐘內達高峰。于15-60分內,A值變化不大,所以比色應在該時間內完成。各部分反應時間對結果影響較大。第17頁4.顯色液出現(xiàn)混濁,可能是溫度太低,使用有機溶劑分層而引起,只要在溫水浴中放置片刻,混濁即可消失。如果玻璃器皿不干凈或過多水蒸氣進入管內也可導致混濁。5.線性范圍為13mmol/L。6.以血漿作標本時,應注意抗凝劑的影響。 通常使用EDTAK2(1mg/ml)作抗凝劑。7.飲食 甘油三酯易受飲食影響,進

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