植物組織培養(yǎng)教材

1、第一章 植物組織培養(yǎng)的應用植物組織培養(yǎng)可應用于以下幾個方面 ：1挽救瀕于滅絕的植物；2快速生殖稀有植物或有較大經(jīng)濟價值的植物；3、生產(chǎn)脫毒苗；4、利用組織培養(yǎng)的材料作為植物生物反應器；多種中草藥資源匱乏，產(chǎn)量不足，甚至瀕于滅絕。利用組織和細胞培養(yǎng)的方法在實驗室內(nèi)生產(chǎn)；可不再依附于自然環(huán)境，不僅能夠解決現(xiàn)有困難，而且能夠通過篩選高產(chǎn)有效成分的細胞系，來提高其藥用價值。如用培養(yǎng)的人參懸浮細胞來生產(chǎn)人參皂苷。利用培養(yǎng)的植物細胞和組織作為生物反應器，也可生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、疫苗等。5、組織培養(yǎng)結合超低溫可經(jīng)濟有效地保存植物種質(zhì)資源 6、組織培養(yǎng)是轉基因技術不可或缺的組成部分；7、作物育種（

2、1）單倍體育種：采納花藥培養(yǎng)可縮短雜合體純化所需的時刻，節(jié)約土地，假定兩個雜交親本在n個獨立遺傳的位點上彼此不同，通過花藥培養(yǎng)，在理論上只要有2n個F1代花粉植株，就有可能得到一個所需要的基因組合，而傳統(tǒng)育種方法，則至少要有4n個F1植株才能得到一個所需要的基因組合。（2）在遠緣雜交中，通過離體授粉或原生質(zhì)體融合有可能克服受精前障礙，通過幼齡合子胚培養(yǎng)能夠克服受精后障礙，通過體細胞融合還有可能制造出細胞質(zhì)雜種。（3）通過細胞培養(yǎng)，在細胞水平上進行突變體選擇，可在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而提高選擇效率，節(jié)約時刻和土地面積。 （4）體細胞無性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三

3、個變異來源。 8、用人工種皮包被體細胞胚制造人工種子，為稀有和寶貴物種的生殖提供了一種高效的手段。9、用于遺傳學、分子生物學、細胞生物學、胚胎學、基因工程、植物發(fā)育等的基礎研究。10、試管花第二章 植物組織培養(yǎng)的進展簡史一、 探究時期(20世紀初至20世紀30年代中) 20世紀初，德國植物生理學家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可不斷分割，直至分到單個細胞的觀點，并設想離體細胞具有再生完整植株的潛力。Haberlandt首次進行了離體細胞培養(yǎng)的實驗，在1902年發(fā)表的“植物離體細胞培養(yǎng)實驗”報告中，提出了胚囊液在組織培養(yǎng)中的作用和看護培養(yǎng)法等科學的預見。 1904年Hannig在

4、無機鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長到成熟。Laibach(1925，1929)把由亞麻種間雜交形成的不能成活的胚剖出，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)至成熟，從而證明了胚培養(yǎng)在植物遠緣雜交中利用的可能性；1922年，美國的Robbins和德國的Kotte分不報道培養(yǎng)離體根尖獲得某些成功。1934年，White成功離體培養(yǎng)了番茄的根尖。 二、 奠基時期(20世紀30年代中至50年代末) 1、White（1934年）在番茄根培養(yǎng)實驗中使用的培養(yǎng)基包含無機鹽、酵母浸出液和蔗糖。他后來(1937)用3種B族維生素（吡哆醇、硫胺素和煙酸），取代酵母浸出液獲得成功。認識了B族維生素對植物

5、生長的重要意義。2、Gautheret(1934)在山毛柳等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)覺，盡管在含有葡萄糖和鹽酸半胱氨酸的Knop溶液中，這些組織能夠不斷增殖幾個月，但只有在培養(yǎng)基中加入了B族維生素和IAA以后，形成層組織的生長才能顯著增加。1939年Gautheret連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜，也建立了類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。因此，Gautheret、White和Nobecourt一起被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。3、Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)發(fā)覺，腺嘌呤或腺苷不但能夠促進愈傷組織的生長，而

6、且還能解除培養(yǎng)基中生長素(IAA)對芽形成的抑制作用，誘導芽的形成，從而確定了腺嘌呤與生長素的比例是操縱芽和根形成的要緊條件之一。 4、1952年，Morel和Martin首次證實，通過莖尖離體培養(yǎng)，能夠由已受病毒侵染的大麗花中獲得無病毒植株。 5、1953-1954年，Muir進行單細胞培養(yǎng)獲得初步成功。把萬壽菊和煙草的愈傷組織轉移到液體培養(yǎng)基中，放在搖床上振蕩，形成了由單細胞和細胞聚攏體組成的細胞懸浮液。Muir等還用機械方法由細胞懸浮液和容易散碎的愈傷組織中分離得到單細胞，把它們置于一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細胞發(fā)生了分裂。 6、1955年，Miller等由鯡魚精子DNA中分離

7、出一種首次為人所知的細胞分裂素，并把它定名為興奮素(kinetin)。7、1957年，Skoog和Miller提出了植物激素操縱器官形成的概念，指出在煙草髓組織培養(yǎng)中，根和莖的分化是生長素對細胞分裂素比率的函數(shù)。8、1958年，Steward等以胡蘿卜為材料，首次通過實驗證實了Haberlandt關于細胞全能性的設想，成為了植物組織培養(yǎng)研究歷史中的一個里程碑。9、1958-1959年，Reinert和Steward分不報道，在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細胞胚。 三、迅速進展時期(20世紀60年代至現(xiàn)在) 1、基礎研究： 1965年，Vasil和Hildebrandt用一種化學成分確定的培養(yǎng)基

8、，由分隔培養(yǎng)的煙草單細胞獲得了完整的再生植株，進一步證實了植物細胞的全能性 。2、原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破： 1960年Cocking等用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe等首次獲得了煙草原生質(zhì)體再生植株。1972年，Carlson等通過兩個煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個體細胞雜種。3、花藥培養(yǎng)取得顯著成績： 1964年，Guha和Maheshwari報道，在毛曼陀羅中通過離體花藥培養(yǎng)由小孢子直接發(fā)育成胚。 1967年，Bourgin和Nitsch通過花藥培養(yǎng)獲得了完整的煙草植株。 4、微繁技術得到廣泛應用 1960年，Morel建立了一個離體無性生殖蘭花

9、的方法，生殖系數(shù)極高。由于這一方法有巨大的有用價值，專門快被蘭花生產(chǎn)者所采納，迅速建立起“蘭花工業(yè)” 。第三章 植物組織培養(yǎng)有關的差不多概念一、植物細胞全能性(totipotency) 細胞全能性:指一個活的植物細胞，只要有完整的膜系統(tǒng)和細胞核，它就會有一整套發(fā)育成一個完整植株的遺傳基礎，在一個適當?shù)臈l件下能夠通過分裂、分化再生成一個完整植株。從理論上講，只要是一個活的細胞，都有再生出一個完整植株的潛力，但實際情況并非如此簡單。就目前所知，細胞的再生潛力與其分化程度呈負相關，確實是講細胞分化程度越高其再生能力越低，因此應盡量選取幼嫩的植物組織作為培養(yǎng)的實驗材料。 二、細胞分化、脫分化與再分化

10、細胞分化分生性細胞在形態(tài)結構和功能上發(fā)生永久性(不可逆轉性)適度變化的過程。脫分化由失去分裂能力的細胞回復到分生性狀態(tài)并進行分裂，形成無分化的細胞團（即愈傷組織）的過程。 再分化由無分化的愈傷組織細胞再轉變成為具有一定結構，執(zhí)行一定生理功能的細胞團和組織，構成一個完整的植物體或植物器官的過程。 三、器官發(fā)生 器官發(fā)生由愈傷組織的部分細胞先分化產(chǎn)生芽(或根)，再在另一種培養(yǎng)基上產(chǎn)生根(或芽)，形成一個完整植株。第四章 植物組織培養(yǎng)所需的差不多設備與條件一個理想的植物組織培養(yǎng)室應包括：1、化學藥品室；2、培養(yǎng)基配制室；3、滅菌室；4、接種室；5、培養(yǎng)室；6、培養(yǎng)物的檢測和觀看記錄室。 一、化學藥品

11、室 應配置幾個藥品櫥、實驗臺、萬分之一和百分之一的電子天平。室內(nèi)還應放一臺大容量的冰箱，用來分門不類地保存激素、抗生素和各種需低溫保存的物品。組織培養(yǎng)所需要緊藥品的存放要求如下： 1、可室溫存放的藥品：無機物、蔗糖、 鹽酸、氫氧化鈉，95酒精，瓊脂。 2、宜于零上低溫存放的化學藥品: 有機物、激素3、應當在一20下保存的藥品： 液體抗生素等。 二、培養(yǎng)基配制室 需要大于40m2的一個房間或更大些，為了方便起見可將房間分為兩個區(qū):一是玻璃器皿的清洗、消毒、干燥區(qū)：二是培養(yǎng)基配制區(qū)：應有大型實驗臺若干個，還應配備常溫冰箱一臺，電爐(1000W，2000W)，微波爐，放置移液管、微量移液器的架子，酸

12、度計等。 三、滅 菌 室 滅菌室面積可小一些，其內(nèi)除放滅菌鍋外，最好還有臨時存放培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿的架子，也應有自來水裝置。滅菌室可依照滅菌鍋的多少，工作量大小來確定面積，要求房間能有較好的通風散熱條件，且要配備專門的電源線路，因為電熱滅菌鍋的耗電量專門大。 四、接 種 室 接種室是對培養(yǎng)的植物材料進行無菌操作的地點，應有超凈工作臺、放置培養(yǎng)容器的架子等。整個房間最好設有緩沖間和雙層門窗，以防灰塵和微生物。房間內(nèi)最好裝有紫外燈或經(jīng)常噴灑殺菌劑，以抑制過多微生物生長。工作人員在進入接種室之前在緩沖間內(nèi)更換衣服、鞋帽、穿好工作服，戴上口罩、防塵帽，換上拖鞋才能進入接種區(qū)，進入接種區(qū)之后隨手把活動門關

13、上。 五、培養(yǎng)室 培養(yǎng)室最重要的是要恒溫、恒濕，無塵且空氣流通。溫度應維持在(253)，相對濕度應在5060%。培養(yǎng)室內(nèi)有規(guī)律地安放培養(yǎng)架或搖床。培養(yǎng)室內(nèi)所有光照和黑暗應由定時器自動操縱。整個培養(yǎng)室內(nèi)還應裝有一個或多個紫外燈，以便能定時對整個房間進行殺菌處理，特不是在夏天潮濕、霉雨季節(jié)，最好每天在晚上用紫外燈殺菌30 min以上。培養(yǎng)室內(nèi)的地面、墻壁、培養(yǎng)架及所有器物的表面都應經(jīng)常清洗、擦拭以防過多灰塵和微生物滋生。 六、培養(yǎng)物的檢測與觀看記錄室 對培養(yǎng)物進行及時的檢測和觀看記錄是研究植物組織培養(yǎng)的重成部分之一，如不及時觀看記錄或?qū)ε囵B(yǎng)物的形態(tài)、結構、生理變化以及培養(yǎng)基變化等進行及時檢測，就不

14、可能獲得準確有效一手資料，也就不能及時地發(fā)覺和找出問題，提出解決問題的方法和改進培養(yǎng)的方案。檢測與觀看記錄室最好單獨設立一個房里面擺放實體解剖鏡、一般光學顯微鏡、顯微照相和記錄設備 。第五章 植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)基配制目前所使用的培養(yǎng)基有10余種之多，大部分差不多上在前人研究的基礎上通過分析綜合和改進而成的。例如，White培養(yǎng)基是Uspenski和Uspenskaia(1925)的藻類培養(yǎng)基演化的結果，被廣泛用于根的培養(yǎng)；Gautheret培養(yǎng)基是建立在Knop營養(yǎng)液(1865)基礎上的。以后的培養(yǎng)基大部分是在White和Gautheret培養(yǎng)基的基礎上改進而成。一、培養(yǎng)基的成分

15、（一）、無機營養(yǎng)成分(包括大量元素，微量元素和鐵鹽)1、大量元素：一般指在培養(yǎng)基中的濃度大于O.5mmolL的元素。氮：常以硝態(tài)氮(N03)或氨態(tài)氮(NH4)，或兩者相互配合的形式存在。缺氮時愈傷組織會出現(xiàn)花色素苷的顏色，愈傷組織內(nèi)部不能形成導管。 磷：常以NaH2P04H2O、KH2P04或(NH4)H2P04的形式提供。鉀：常以KCl、KN03或KH2P04形式。 鈣：常以CaCl22H2O、Ca(N03)2。鎂：常以MgS047H2O的形式，既提供了鎂也提供了硫。缺硫時培養(yǎng)的植物組織會明顯的退綠；缺磷或鉀時細胞會過度生長，愈傷組織表現(xiàn)出極其蓬松狀態(tài)。 2微量元素：指小于O.5mmolL的

16、元素。 要緊包括鐵(Fe)、錳(Mn)、銅(Cu)、鋅(Zn)、氯(C1)、硼(B)和鉬(Mo)等。 鐵作為一種微量元素，對植物也是必需的，但由于Fe的專門性質(zhì)，即專門不穩(wěn)定、易沉淀，需要在酸性條件下才能比較穩(wěn)定，故在培養(yǎng)基配制時常常把Fe鹽單獨配制，且常以螯合物的形式，把FeS04和它的螯合劑乙二胺四乙酸鈉(Na2EDTA)先分不配成溶液，再相互混合使形成螯合鐵，以防止沉淀和關心被植物汲取。 （二）、有機營養(yǎng)成分 維生素: 除維生素B1、維生素B6、煙酸之外，在部分培養(yǎng)基中還添加維生素C(抗壞血酸)、維生素H(生物素)等。甘氨酸(氨基乙酸)和肌醇(環(huán)己六醇):肌醇要緊以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的

17、形式參與由Ca介導的信號轉導。另外，在某些植物或某些組織的培養(yǎng)中還加有水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、西紅柿汁和酵母浸出物等。 （三）、碳水化合物用作碳源的碳水化合物通常為蔗糖或葡萄糖，用量通常為24%，高者可達5，亦可用市售的白糖所代替。 幾乎所有的培養(yǎng)物在蔗糖作為碳源時生長都比較好，只有少數(shù)植物或組織在葡萄糖或果糖作為碳源的培養(yǎng)基上生長更合適。也有用麥芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨醇和乳糖作為碳源的。 （四）、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 在植物組織培養(yǎng)中使用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)要緊有生長素類和細胞分裂素類兩大類，少數(shù)培養(yǎng)基中還添加赤霉素GA3等。1生長素：要緊被用于誘導刺激細胞分裂和根的

18、分化。常用的生長素有：NAA(萘乙酸)，IAA(吲哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，NOA(萘氧乙酸)，2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)，2，4，5一T(2，4，5一三氯苯氧乙酸)。對愈傷組織增殖最有效的是2，4一D，特不是對單子葉植物。但2，4-D是一種極有效的器官發(fā)生抑制劑，不能用于啟動根和芽分化的培養(yǎng)基中。 2細胞分裂素 使用細胞分裂素的要緊目的是刺激細胞分裂，誘導芽的分化、葉片擴大和莖長高，抑制根的生長。 常用的天然CTK要緊有：玉米素,玉米素核苷，二氫玉米素 。常用的人工合成CTK要緊有: 興奮素(KT)、6-芐基腺嘌呤(6-BA)、2ip(異戊烯氨基嘌呤)、和TDZ(thidiazu

19、ron，噻二唑苯基脲)等 。3赤霉素 ：要緊是GA3。用時需過濾滅菌；促進試管苗伸長。 （五）、瓊脂或其他支持物 除液體懸浮培養(yǎng)外，所有的培養(yǎng)物都應生長在固體或半固體的培養(yǎng)基上,以防止培養(yǎng)物沉人液體培養(yǎng)基，因缺氧而死亡。瓊脂是一種極為理想的支持物。它是由海藻得來的多糖類物質(zhì)，但并不是培養(yǎng)基中的必需成分，只是作為一種凝固劑使培養(yǎng)基變成固體或半固體狀態(tài)。（六）、其他添加物 ：酵母提取物，椰乳，香蕉粉，橘子汁，活性炭，滲透調(diào)節(jié)劑、水解酪蛋白、水解乳蛋白等。1活性炭：能從培養(yǎng)基中吸附許多有機物和無機物分子，可清除培養(yǎng)中植物組織在代謝過程中產(chǎn)生的、對培養(yǎng)物有不良或毒副作用的物質(zhì)，也能夠調(diào)節(jié)激素的供應。活

20、性炭還有刺激胚胎發(fā)生(如煙草花藥培養(yǎng))或組織生長和形態(tài)發(fā)生的作用。2滲透調(diào)節(jié)劑：常選用一些代謝微弱的糖來充當，如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等，這些糖差不多上不被培養(yǎng)的植物組織所汲取，而只存留在培養(yǎng)基中，起到調(diào)節(jié)滲透的作用。3抗生素：培養(yǎng)的植物組織內(nèi)部攜帶有病原物，表面消毒不解決問題時，可在配置培養(yǎng)基時添加抗生素，如加200300U的慶大霉素可使細菌污染受到專門好的操縱。 二、培養(yǎng)基的選擇 1選擇合適的培養(yǎng)基 差不多培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基適合于大多數(shù)雙子葉植物，B5和N6培養(yǎng)基適合于許多單子葉植物， White培養(yǎng)基適于根的培養(yǎng) 激素濃度和相對比例的確定 先參考已有的報道，看是否有用相同植物、

21、相同組織或相近者做過成功或失敗的試驗，假如有則直接作為參考；假如沒有，則在建立激素配比中，將每一種擬使用的激素選擇35個水平，再按隨機組合的方式建立起如下的實驗方案。 三、培養(yǎng)基的配制 （一）、配制母液（二）、配制培養(yǎng)基 (三)、配制培養(yǎng)基時應注意的有關問題 1、高溫滅菌的差不多過程 檢查滅菌鍋內(nèi)有無足夠量的水，最好用蒸餾水或去離子水，因為自來水含有較多的礦物質(zhì)，容易使鍋內(nèi)形成水垢，阻礙鍋的使用壽命。將需要滅菌的器皿、培養(yǎng)基等放入鍋內(nèi)，不要裝得太滿，以不超過鍋的容量34為宜。 2、高溫下培養(yǎng)基成分的降解 經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新奇溶液的10。NAA、2，4一D、興奮素

22、和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長的物質(zhì)。高溫可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性，但假如培養(yǎng)基的pH值高于5.5，則維生素B1會被迅速降解。 第六章 無菌操作技術與設備一、干熱滅菌 干熱滅菌確實是在180的烘箱內(nèi)對器皿進行殺菌處理，是一種完全殺死微生物的方法。適合于干熱滅菌的器皿和物品有：玻璃器皿，如三角瓶、燒杯、量筒等；金屬物品，如鑷子、解剖刀、剪刀等；能夠高溫滅菌的塑料制品。二、濕熱滅菌濕熱滅菌確實是人們平常所講的蒸汽滅菌。滅菌的溫度為121，壓力為103.4 kPa，滅菌時刻

23、除液體外要求在121下維持15 min以上。液體滅菌時刻可依據(jù)體積而定，體積越大，需要時刻越長，如2.5L需20min，10L需28min，25L需31min。 濕熱滅菌時應注意以下問題：1、不能隨意延長滅菌時刻，因為延長時刻會使一些化合物過多分解，特不是蔗糖會分解為單糖，使培養(yǎng)基pH降低，瓊脂不能專門好的凝固；2、假如滅菌鍋沒有吹干程序，從鍋內(nèi)取出的紙制品、紗布等最好立即轉到60的溫箱中吹干；3、由于錫箔紙不透氣，推舉使用牛皮紙或報紙等包裝物品，以利于水分快速蒸發(fā)；4、滅菌鍋所裝蒸餾水或去離子水應經(jīng)常更換，以防止微生物污染和水中雜質(zhì)過多，給滅菌鍋和要滅菌的物品帶來不利阻礙； 三、微過濾滅菌是

24、使需要滅菌的液體通過一個微孔濾膜，以除去液體中的微生物、微顆粒等，過濾的范圍是0.025lOm。這種方法關于高溫滅菌容易引起分解的物質(zhì)最為適宜，如容易分解的維生素、激素、植物組織提取物、抗生素等。微過濾滅菌的關鍵部分是微孔濾膜，如要完全清除細菌、酵母等微生物，最好使用0.22m的濾膜。如要獲得原生質(zhì)體，則可使用O.45m的濾膜。 四、化學藥物滅菌 1、鑷子、解剖刀等器具的滅菌：將預備使用的鑷子、解剖刀等浸入75%酒精中，器具的大半部分都被酒精浸泡。使用時取出鑷子或解剖刀，放在酒精燈上加熱至酒精完全除去為止，用完后再放回75%酒精中。2、外植體的滅菌：將植物材料先用自來水加洗潔精少許浸泡10mi

25、n以上，浸泡期間要輕輕攪動幾次，以便使植物材料與溶液充分接觸，然后用自來水沖洗10 min左右。在超凈工作臺上，將材料在70酒精中進行表面預消毒30秒，倒掉酒精，再用O.1升汞(HgCl2)進行消毒8分鐘左右，或用1次氯酸鈉(NaOCl)或次氯酸鈣Ca(OCl)2消毒20 min左右，具體時刻要依照材料而定。然后用無菌水沖洗34次，每次2 min左右。次氯酸鹽在pH6.O左右時活性較高，高于8.0時幾乎無活性；通常往消毒液中添加幾滴吐溫20或吐溫80等表面活性劑，以提高滅菌效果。 五、抗生素滅菌 首先必須弄清晰要殺死的是真菌、細菌依舊病毒，是哪類真菌、哪類細菌或病毒；其次應明白使用的抗生素是否

26、對培養(yǎng)的植物組織有不良阻礙；最后要確定抗生素的使用濃度、使用時期和處理時刻的長短?？股氐氖褂弥荒苁怯米黝A防微生物污染的方法，而不能用于殺死微生物，因此在使用時最好加在培養(yǎng)基當中，而不宜作為一種殺菌劑單獨使用。因為農(nóng)桿菌介導法已成為植物基因轉移的一個要緊方法，在轉基因過程中的除菌和抑菌都離不開抗生素，因此使用抗生素已逐漸成為植物組織培養(yǎng)中的滅菌技術之一。六、無菌操作中其他應注意的問題 注意防止紫外線的危害 植物組織培養(yǎng)室和超凈工作臺上的紫外燈開放時刻不可太長，最好在30min之內(nèi)。超凈工作臺上的紫外燈關閉以后不要立即走近工作臺，最好讓無菌風吹23 min后再開始操作。 第七章 離體快速生殖方法

27、微繁在無菌條件下進行植物的無性生殖。1960年，Morel提出了一個離體無性生殖蘭花的方法，生殖系數(shù)極高。使微繁技術真正有用化。 一、無菌培養(yǎng)物的建立 1、外植體的選擇：莖段、莖尖、葉片、嫩芽、鱗莖的鱗片、花器官等。 注意：（1）、在生長季節(jié)開始時由活躍生長的枝條上切取的外植體，通常能產(chǎn)生最好的效果。（2）、關于需要低溫、高溫或?qū)ｉT的光周期才能打破休眠的鱗莖、球莖、塊莖和其他器官，應當在取芽之前進行必要的處理。2、消毒二、莖芽的增殖（一）莖芽增殖的類型1、器官型(organ type) 以芽增殖芽的方法，其遺傳性狀穩(wěn)定，成為目前快速生殖中采納的要緊方法。2、器官發(fā)生型(organogenesi

28、s type) 外植體先脫分化形成愈傷組織，再分化出器官的方式。3、胚狀體發(fā)生型(embryoid type) 體細胞增殖發(fā)育的順序與受精卵發(fā)育極為相似，通過原胚一球形胚一心形胚一魚雷胚一子葉胚5個時期，最后發(fā)育成完整的植株。胚狀體可從愈傷組織形成，也可不通過脫分化直接從子葉、下胚軸和花藥培養(yǎng)形成。通過胚狀體的培養(yǎng)能夠獲得大量的植株，大大提高生殖率4、原球莖型(protoeomb type) 目前蘭花的快速生殖要緊靠原球莖的分化方式。 5、球莖芽型(globose stem bud type) 觀葉海棠的葉柄表面可產(chǎn)生一個個圓球形的小突起（球形莖），小突起的一端產(chǎn)生芽和葉片，另一端長出根，最后

29、形成完整的小植株。 6 塊莖型(tuber type) 花葉芋的葉片或葉柄上，先形成類似愈傷組織的小硬粒突起，并逐漸形成粒狀的芋塊。隨后粒狀芋塊上分化出新的14個小突起。由小突起上分化出芽原基。隨著小芋塊的增大，分化出的芽也越密集并形成許多小苗，在小苗基部與芋塊交界處分化出白色的根。 7 鱗莖型(bulb type) 百合的鱗莖切塊基部近軸面或在邊緣直接形成帶根的小鱗莖。如卷丹鱗片的頂部、中部和基部均能誘導分化出小鱗莖。郁金香鱗莖旁又會分化出小鱗莖。（二）器官發(fā)生型 1 愈傷組織形成的條件 誘導愈傷組織常用的生長素是2，4一D，IAA和NAA，常用的細胞分裂素是KT和6-BA。在禾谷類植物中，

30、只用2，4一D就能成功地誘導愈傷組織。多數(shù)情況下誘導愈傷組織既需要生長素，也需要細胞分裂素。黑暗條件下有利于愈傷組織的形成，光照對組織的愈傷化有抑制作用。 2 愈傷組織狀態(tài)的調(diào)控 優(yōu)良愈傷組織須具備的特性： (1)高度的胚性或再分化能力，以便得到再生植株；（2）容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系；（3）旺盛的自我增殖能力，以便建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。（4）通過長期繼代保存不喪失胚性，以便對它們進行各種遺傳操作。 愈傷組織狀況調(diào)整的策略 （1）選擇適當?shù)幕蛐秃屯庵搀w。如禾谷類植物愈傷組織培養(yǎng)的成功，是由于選擇了未成熟胚和幼穗作為外植體，它們的根和幼葉盡管也能形成愈傷組織，但差不多

31、上非胚性的。（2）選擇正確的培養(yǎng)基，特不是正確的植物激素種類和濃度，及二者之間正確的配比。 （3）采納某些專門的理化因素，改變愈傷組織誘導培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。如在玉米幼胚愈傷組織培養(yǎng)中，通過在培養(yǎng)基中添加5mgL或10 mgL AgNO3，抑制組織內(nèi)乙烯的作用。（4）還原態(tài)氮具有促進細胞分裂的作用，硝態(tài)氮具有抑制細胞分裂的作用。增加培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮(或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有機形式的還原態(tài)氮)可明顯促進細胞分裂；增加培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮或減少還原態(tài)氮，可顯著抑制細胞分裂。 3 阻礙莖芽分化的因素 化學因素 （1）細胞分裂素/生長素 在莖芽誘導中，2ip在通常情況下是最為有效的。（2）生長素能

32、抑制芽的形成: 在煙草中，濃度低到5molL的IAA即足以完全抑制莖芽的自發(fā)分化。當與興奮素或腺嘌呤結合使用時，生長素能夠抵消它們促進莖芽形成的作用。（3）赤霉素關于莖芽的分化有抑制作用:在煙草中，若把正在分化的愈傷組織在黑暗條件下以GA3處理，時刻即使短至3060min，也會減少芽的分化，而且在處理之后48h，所有的擬分生組織或莖芽全都不復存在。 物理因素 （1）瓊脂濃度： 在培養(yǎng)煙草薄層組織時，當瓊脂為l時，只能形成花；隨著瓊脂濃度的下降，花的形成頻率減少，營養(yǎng)芽的分化出現(xiàn)。在液體培養(yǎng)基中，則只能愈傷化和分化營養(yǎng)芽 ；（2）滲透壓： 在由馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體獲得的愈傷組織中，只有在培養(yǎng)基里加

33、入0.2O.3 molL甘露醇以使?jié)B透壓保持在200到400毫滲透壓摩爾時，才可能出現(xiàn)莖芽的分化。 （3）光照： 高強度的光照對煙草莖芽的形成有抑制作用。天竺葵愈傷組織只有在光照和黑暗周期交替(1516 h光照最好)條件下才能分化莖芽，培養(yǎng)在連續(xù)光照下的愈傷組織總是白色的，不表現(xiàn)器官發(fā)生。光質(zhì)對器官分化也有阻礙。在煙草中藍光促進莖芽分化，紅光刺激生根。 （4）溫度： Skoog(1944)在533的范圍內(nèi)研究了溫度對煙草愈傷組織生長和分化的阻礙，發(fā)覺直到33時愈傷組織的生長都隨溫度的上升而增加，但只有在18時最適合莖芽的分化，在33時不能形成莖芽。 其他因子：培養(yǎng)材料的染色體組，供體植株和外植

34、體的生理狀態(tài)，外植體的細胞發(fā)育狀態(tài)，培養(yǎng)物的歷史以及內(nèi)生激素水平。 （三）阻礙莖芽增殖的因素1、無機鹽水平 對有些植物來講，MS培養(yǎng)基中的無機鹽水平或有毒或太高。如烏飯樹的莖芽在只含14強度MS無機鹽的培養(yǎng)基中能長得專門好，無機鹽水平再高或是有毒或是并沒什么好效果。2、激素 CTK 為了獲得健壯的莖芽應適當降低細胞分裂素濃度。細胞分裂素使用的 濃度范圍是O.55 mgL，大多數(shù)適當?shù)臐舛仁? 2 mgL。GA 為促使莖的伸長，有時加入GA； 生長素 在進行莖芽生殖時，IAA、NAA使用的濃度范圍是0.11mgL。3、瓊脂 微繁所用的培養(yǎng)基通常都用0.6 %O.8的瓊脂固化。但在卡特蘭和大多數(shù)鳳

35、梨科植物中，只有在液體培養(yǎng)基中才能把培養(yǎng)建立起來。應用液體振蕩培養(yǎng)的一個專門優(yōu)點是莖芽一邊增殖一邊彼此離散，不必用人工把成簇的莖芽切開。4、光照和溫度光的作用只是滿足某些形態(tài)發(fā)生過程的需要，因此10005000 lx的光強即已足夠。光周期嚴格地講也是不重要的。每天16 h光照8 h黑暗交替照明，即可產(chǎn)生令人中意的效果。培養(yǎng)室的溫度一般恒定在25左右。 三、離體枝條的生根 1、試管內(nèi)生根 1）生根培養(yǎng)基應降低鹽的濃度，減少到12MS或14MS。 2）誘導生根需要有適當?shù)纳L素，最常用的是NAA和IBA，濃度一般為O.1 10.O mgL。3）關于難生根的植物，可嘗試把它們的下端浸在高濃度生長素溶

36、液中若干時刻(由幾秒到幾小時)之后，再插于無激素培養(yǎng)基中。4）在生根培養(yǎng)基中減少蔗糖濃度(如減到1)和增加光照強度，能刺激小植株通過光合作用制造食物的能力，以便由異養(yǎng)型過渡到自養(yǎng)型。5）枝條在離體條件下生根所需的時刻由10d到15d不等。根長15mm左右時移栽最為方便，更長的根在移栽時易斷，會降低植株的成活率。 2、試管外生根 在有些植物中，能夠把在離體條件下形成的枝條當做微插條處理，使它們在土中生根。在這種情況下，須把插條的基部切口先用標準的生根粉或混在滑石粉中的IBA處理；有些植物如月季，則可先在試管內(nèi)誘導枝條形成根原基，然后再移栽土中，遮蔭保濕，待其生根。試管外生根由于減少了一個無菌操作

37、步驟，因而可降低成本。 無根苗的嫁接 試管內(nèi)嫁接(微體嫁接): 即以試管苗的0.1O.2mm長的莖尖為接穗 ，以在試管內(nèi)預先培養(yǎng)出來的帶根無菌苗為砧木，在無菌條件下借助顯微鏡進行嫁接，之后接著在試管內(nèi)培養(yǎng)，愈合后成為完整植株再移入土中。 試管外嫁接: 無籽西瓜試管苗嫁接到瓠子上后，在溫度為2530，相對濕度差不多飽和的條件下，3d后傷口長出愈傷組織，1周后成活并長出新葉。 四、壯苗、煉苗和移栽 需壯苗、煉苗的緣故 ：試管苗生長在恒溫、高濕、弱光、無菌和有完全營養(yǎng)供應的條件下，雖有葉綠素，但營異養(yǎng)生活，在形態(tài)解剖和生理特性上都有專門大脆弱性，如無角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，氣孔開張過大且不具備關閉功能等。如

38、此的試管苗若未經(jīng)充分鍛煉，一旦被移出試管，投入到一個變溫、低濕、強光、有菌和缺少完全營養(yǎng)的條件下，必定要被劇變的環(huán)境所吞噬。 壯苗： 是移栽成活的首要條件，在培養(yǎng)基中加入一定數(shù)量的生長延緩劑如多效唑(PP333)，B9或矮壯素(CCC)等，在專門多種植物中差不多上培育壯苗的一項有效措施。煉苗： 壯苗之后則須開瓶，降低瓶中濕度，增強光照強度，以便促使葉表面逐漸形成角質(zhì)，促使氣孔逐漸建立開閉機制，促使葉片逐漸啟動光合功能等。 移栽： 先要輕輕地、完全地洗掉沾在根上的瓊脂培養(yǎng)基，以免栽后發(fā)霉。要選用排水性和透氣性良好的移栽介質(zhì)，例如蛭石、河沙、珍寶巖、腐植土等。移栽后，最初1015 d要通過噴霧或罩

39、上透明塑料以保持專門高的濕度(90%100)。 五、微繁中存在的一些問題 1、物種的局限性專門多難于用傳統(tǒng)方法生殖的重要樹木，包括若干裸子植物，離體生殖技術還未過關。2、無性系變異 在商業(yè)性微繁當中，一旦無菌培養(yǎng)差不多建立，人們就禁不住以此為起點連續(xù)生殖若干世代，結果就有可能使培養(yǎng)早期發(fā)生的變異(芽變或偶然變異)累積起來。假如是通過愈傷組織進行微繁的話，通過長期繼代培養(yǎng)之后，再生植株中出現(xiàn)變異的可能性更大。3、培養(yǎng)物污染在植物大規(guī)模微繁期間，即使外植體在一開始進行了嚴格的表面消毒，某些慢速生長的病原菌(特不是內(nèi)生菌)可能依舊存在，但只有在培養(yǎng)物通過多次繼代之后，這些污染物才表現(xiàn)出來并被人們所發(fā)

40、覺。4、玻璃化玻璃化現(xiàn)象是植物組織培養(yǎng)過程中特有的一種生理失調(diào)或生理病變，多數(shù)發(fā)生在植物莖尖培養(yǎng)和離體快繁中。玻璃苗生長生殖速度下降，最后甚至死亡。玻璃化的誘因 外植體類型、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等各種內(nèi)外因素都可能是玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)的緣故，其中比較重要的如瓊脂用量太低或細胞分裂素濃度過高，培養(yǎng)溫度過高，光照不足以及乙烯合成增加等。 5、培養(yǎng)基的褐變 褐變的緣故： 由外植體的切口表面滲出的酚類物質(zhì)氧化后成為醌類物質(zhì)，使培養(yǎng)基變成暗褐色，從而對組織產(chǎn)生毒害作用。 克服培養(yǎng)基褐變的措施 1、以幾天的時刻間隔將外植體轉到新奇培養(yǎng)基上23次，在這段時刻內(nèi)外植體的切口愈合，酚類物質(zhì)外滲停止。 2、把由親本植

41、株上直接采集的莖芽，先在一種液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，然后再在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；蛴诮臃N的第一個星期之內(nèi)，每天更換一次液體培養(yǎng)基 。3、在培養(yǎng)基中加入一些抗氧化物，如鹽酸半胱氨酸(100mgL)、抗壞血酸(50100mgL)或者是檸檬酸(150mgL)。 4、使用能夠汲取酚類化合物的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，用量一般為0.01)、活性炭(O.10.5) 。5、由于光能促進酚的氧化，開始時把培養(yǎng)物置于暗處也可能有助于減輕褐變的問題。6、適當降低培養(yǎng)溫度。 第八章 體細胞胚胎發(fā)生一、體細胞胚(somatic embryo)或胚狀體(embryoid)的概念 指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞、通過

42、胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的具有雙極性的胚狀結構。 胚狀體的特點： 1、不是兩性細胞融合的產(chǎn)物；2、 不同于孤雌胚或孤雄胚，不是無融合生殖的產(chǎn)物；3、不同于器官發(fā)生途徑形成的莖芽和根，它的形成須經(jīng)歷與合子胚相似的發(fā)育過程，而且成熟的胚狀體是一個雙極性結構。 二、體細胞胚發(fā)生研究的歷史離體條件下的體細胞胚胎發(fā)生過程最早是在胡蘿卜中由Reinert（1958）和Steward等（1958）發(fā)覺的。 迄今已在分屬于40余科（包括裸子植物）的100多個種植物中有過關于體細胞胚胎發(fā)生的報道。能產(chǎn)生體細胞胚胎的外植體有：單倍體的小孢子；二倍體組織如莖段、子葉、莖尖、葉柄、貯藏根的韌皮部和木質(zhì)部等；三倍體的

43、胚乳。三、體細胞胚胎發(fā)生的方式 1、從培養(yǎng)中的器官、組織、細胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，中間不通過愈傷組織時期，如石龍芮再生植株莖表面長出不定胚。 2、外植體先愈傷化，然后由愈傷組織細胞分化成胚，如石龍芮花器愈傷組織成胚，從愈傷組織產(chǎn)生胚狀體最為常見。 A、由外植體外層細胞直接產(chǎn)生體細胞胚 B、由外植體組織內(nèi)的細胞產(chǎn)生體細胞胚C、愈傷組織表層細胞分化為體細胞胚 D，E、多個或單個細胞形成體細胞胚 四、體細胞胚胎發(fā)生及植株再生研究的意義 （1）植物細胞分化、全能性表達過程和機理等重大理論問題的研究提供了理想的實驗體系 ；（2）人工種子的制作，是促進離體快速生殖、實現(xiàn)田間和溫室栽培的重要途徑；（3）

44、胚性愈傷組織可在適宜的條件下長期保存，為解決瀕危植物挽救等問題提供了可能；（4）胚性愈傷組織具有遺傳穩(wěn)定、再生頻率高的特點，關于基因工程特不適用； （5）體胚發(fā)生過程中眾多體細胞無性系變異為突變體的篩選提供了新的來源； (6)以胚性細胞為材料制備原生質(zhì)體，為細胞分化和植株再生等奠定了基礎。 五、阻礙植物體細胞胚發(fā)生及植株再生的因素 1、基因型的阻礙 2、外植體種類：外植體的類型、所處發(fā)育和生理狀態(tài)以及取材部位等因素均阻礙體胚發(fā)生。甚至外植體形態(tài)學部位也是阻礙因素之一。幼嫩的生殖器官較容易由外植體直接產(chǎn)生體細胞胚胎。而幼嫩的營養(yǎng)器官則一般需經(jīng)愈傷組織途徑產(chǎn)生體細胞胚胎。 3、預處理：在一些植物體

45、胚誘導中，如預先低溫(48)儲藏12個月。4、培養(yǎng)基種類及其成分培養(yǎng)基種類 體胚誘導中70采納MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基中含較高水平的NH4NO3和螯合鐵。對體胚發(fā)生有促進作用。氮源 在胡蘿卜葉柄節(jié)段培養(yǎng)物中，只有當培養(yǎng)基里含有一定數(shù)量的還原態(tài)氮時，才能出現(xiàn)胚胎發(fā)生過程。在以KN03為唯一氮源的培養(yǎng)基上建立起來的愈傷組織，去掉生長素以后不能形成胚。然而，若在含有55mmolL KNO3的培養(yǎng)基中加入少量(5mmolL)NH4C1形態(tài)的氮，胚胎發(fā)育過程就會出現(xiàn)。 碳源 作為外植體的滲透壓調(diào)節(jié)物和體胚發(fā)育的能源物質(zhì)，碳源對體胚發(fā)生有重要阻礙。在柑橘體胚發(fā)生中，適當濃度的甘油大大刺激了愈傷組織的生長和胚

46、胎發(fā)生，而且能獲得同步操縱。蘋果離體葉片培養(yǎng)時，在保證碳源供應的前提下，降低蔗糖濃度有利于直接體胚發(fā)生。高濃度的鉀 在野生胡蘿卜中，高濃度的鉀(20mmolL)是胚胎發(fā)生所必需的。培養(yǎng)基中溶解氧 在培養(yǎng)基中溶解氧的含量應低于一個臨界值(1.5mgL)，否則將有利于生根，而不利于成胚。這是因為低水平的溶解氧在細胞內(nèi)會導致高水平的ATP。假如加入ATP，則有可能取代對低水平溶解氧的需要。 活性炭 在培養(yǎng)基中加入活性炭也能提高胡蘿卜細胞胚胎發(fā)生的頻率。酵母提取物在培養(yǎng)基中加入酵母提取物能提高胡蘿卜細胞胚胎發(fā)生的頻率。植物激素 生長素類：多數(shù)植物誘導胚性愈傷組織需用2.4一D，特不是單子葉植物。而且胚

47、性細胞發(fā)育時還必須及時降低或去掉2，4一D。但低濃度的生長素是大多數(shù)植物誘導體胚發(fā)生所必需的。細胞分裂素類：許多植物體胚發(fā)生的誘導必須加入外源生長素和細胞分裂素，CTK在裸子植物中起著比生長素更重要的作用。（3）脫落酸：外源ABA可促進枸杞、石刁柏等胚性愈傷組織的形成和體胚的發(fā)生。保持秈稻愈傷組織的胚性結構，并使其綠苗分化率明顯提高。(4)乙烯及多胺： 低濃度的乙烯利顯著刺激胚胎發(fā)生，高濃度則抑制胚胎發(fā)生。 外源多胺或其前體可使人參體胚發(fā)生數(shù)增加4倍；外源Put使茄子體胚發(fā)生數(shù)增加6倍，并伴隨內(nèi)源Put增加，而抑制多胺合成和降解則使體胚發(fā)生數(shù)減少。（5）赤霉素：抑制許多植物胚狀體的發(fā)生，但對胚

48、狀體的進一步發(fā)育成熟及胚的萌發(fā)效果專門好 5、培養(yǎng)條件 暗培養(yǎng)對體胚發(fā)生過程中的胚性愈傷組織的誘導及胚狀體的發(fā)生、發(fā)育和成熟十分關鍵。 六、體細胞胚發(fā)生過程中的生理生化變化 1、ATP酶活性提高，且早期的胚性細胞中ATP酶反應產(chǎn)物要緊沉積于質(zhì)膜和液泡膜上，后期ATP酶活性轉入細胞內(nèi)、液泡和細胞核中。2、在多數(shù)植物的SE發(fā)生中過氧化物酶(POD)的活性較高，同工酶的種類較多。在大麥中POD、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的結合應用能夠作為SE發(fā)生的標志酶。3、胚性愈傷組織中的可溶性蛋白質(zhì)含量遠高于非胚性愈傷組織；而非胚性細胞的游離氨基酸高于胚性細胞。4、胚性愈傷組織中都存在45KD至55KD的胚胎發(fā)生特

49、異性蛋白質(zhì)的合成。5、體細胞胚發(fā)生與發(fā)育過程中，不僅RNA合成速率遠高于非胚性愈傷組織，且RNA種類豐富。隨著體細胞胚發(fā)育的進程，DNA合成量明顯增加，至球形胚時DNA的合成量達到峰值。 6、內(nèi)源激素含量的變化 內(nèi)源IAA含量上升并維持在較高水平是胚性細胞出現(xiàn)的一個共同標志；在胚發(fā)生早期，較高水平的內(nèi)源CTK對體胚發(fā)生大概是必須或有益的；內(nèi)源ABA有利于體胚發(fā)育和成熟。低水平乙烯有利于胚性能力的啟動或表達，高水平乙烯抑制體胚發(fā)生。高水平多胺促進體胚發(fā)生。在皇冠草體細胞胚胎發(fā)生中，GA3的變化趨勢和細胞分裂素差不多相同。 七、人工種子 Murashige于1978年在國際園藝植物學術討論會上首先

50、提出人工種子的概念。指將植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的體細胞胚或能發(fā)育成完整植株的分生組織（芽、愈傷組織等）包埋在含有營養(yǎng)物質(zhì)和具有愛護功能的外殼內(nèi)形成的在適宜條件下能夠發(fā)芽出苗的顆粒體。完整的人工種子包括體胚、人工胚乳和人工種皮。 Kitto等用聚氯乙烯包裹胡蘿卜胚狀體于1981年首次制成了人工種子。我國于1995年首次制成了特種稻的人工種子。我國將其列入國家863打算。通過20余年的研究，人工種子的研究取得了專門大進展，已能在有菌條件下發(fā)芽成苗或用于大田和溫室生產(chǎn)。 （一）研制人工種子的意義 1、快速生殖遺傳工程植物、自交不親合植物、稀有寶貴物種或遠緣雜種等； 2、在人工種子的制作過程中還可加人多種

51、生長調(diào)節(jié)劑、有益微生物、農(nóng)藥、除草劑等以提高品種的抗逆境能力；3、人工種子還具有節(jié)約種源、不占用土地，一年四季均可工廠化生產(chǎn)的特點 。（二）人工種子的研究現(xiàn)狀 早期的人工種子研究僅限于胡蘿卜、苜蓿、芹菜等模式作物，當時包埋的材料僅胚狀體；而目前研究范圍己轉向水稻、甘薯、棉花等具重要經(jīng)濟價值的糧食作物；包埋材料除用胚狀體外還有胚類似物，即用芽、短技、愈傷組織、花粉胚。用這類材料包埋的人工種子變異小、萌發(fā)率和成苗率高。如以腋芽為材料進行人工種子研究的作物有煙草和花葉芋，也有用毛狀根為培養(yǎng)物制作人工種子的研究 。（三）人工種子的包埋 Redenhaugh于1984年首次篩選出透水性好的海藻酸鈉作為胚

52、狀體和不定芽的包埋劑。 海藻酸鈉(23.2，WV)在室溫下為液體。當體細胞胚與藻酸鈉混合以后，再滴入到硝酸鈣或氯化鈣溶液(100 mmolL)中，30 min內(nèi)表面即可完全絡合，形成一層持久的種皮(圖8.4)。此外，在種皮基質(zhì)中還可加入一些對體細胞胚有益的物質(zhì)，如能促進生長的微生物、營養(yǎng)物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、殺蟲劑，以及用于旱地播種的親水性化合物等，作為人工胚乳。 第九章 植 物 脫 毒 技 術脫毒的重要性 有許多優(yōu)良的傳統(tǒng)品種，由于長期栽培，尤其是愛護地栽培面積不斷擴大，植物周年生長，寄主與病原媒介密度增加，導致病害日益嚴峻。其中以病毒病最難操縱，成為當前生產(chǎn)上的嚴峻問題。 病毒的侵染，抑制植

53、株生長，使形態(tài)畸變，產(chǎn)生皺縮、花葉、雜斑、條斑等多種癥狀，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣。對無性生殖作物危害更甚，如薯類、大蒜、生姜、芋頭、草莓和花卉等。受病毒侵染的植株，可經(jīng)無性生殖器官傳至下一代。病毒隨生殖代數(shù)增加而綿延不絕，日益增殖，結果導致植物種性退化，甚至使一些珍稀品種瀕臨絕滅。 植物脫毒技術的歷史 第一株植物脫毒苗是1952年由法國人Morel等通過大麗花莖尖組織培養(yǎng)獲得的。1955年他們又獲得了馬鈴薯脫毒苗。20世紀70年代，幾乎所有生產(chǎn)馬鈴薯的國家都在生產(chǎn)中使用這一技術。病毒傳染的途徑 1、非介體傳播 通過感病植株本身的有性或無性生殖材料完成的傳染作用。是植物病毒從感病寄主體通過機械摩擦造

54、成的微傷(稱機械汁液傳染)，或通過感病和無病寄主體細胞間的有機結合傳染的，如帶病的鱗莖、塊莖、塊根、插條、嫁接苗、種子和花粉等。目前了解到由種子傳染的病毒有104種，花粉傳染的病毒有10多種。機械摩擦要緊指田間病健株間的相互摩擦，或人為的接觸摩擦。 2、介體傳播通過帶毒或感染的昆蟲或其他生物介體而完成的傳染作用。介體傳播要緊是昆蟲，其次是線蟲、螨類和真菌。介體傳毒?；詷O強， 一、蝴蝶蘭種苗生產(chǎn)概況蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)在中國的興起只是十余年，作為花卉業(yè)中的一個新興類不，蝴蝶蘭一直受到中國花卉市場的喜愛。 目前，歐洲、美國、日本、韓國是世界要緊的蝴蝶蘭消費市場。僅在2005年，全球蝴蝶蘭消費量已達到1.5

55、億株，可能到2008年，全球?qū)m的需求量將達2.5億株左右。全球蝴蝶蘭種苗的大幅度增長要緊得益于以荷蘭為代表的歐洲市場和美國市場的強勁需求。從2004年起，荷蘭市場蝴蝶蘭消費量從3500萬株上升到2006年的8000多萬株。2007年可能需求在1億株；在美國蝴蝶蘭已全年消費額接近2億美元。 2006年，國內(nèi)蝴蝶蘭市場的產(chǎn)量約在4500萬株，其中60%左右用于出口，但要緊集中在瓶苗與大、中、小苗。國內(nèi)消費的蝴蝶蘭不到2000萬株，相關于寬敞的市場與人口基數(shù)，國內(nèi)蝴蝶蘭市場還有專門大的拓展空間。隨著世界蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)向中國轉移，中國將成為全球蝴蝶蘭的第一大生產(chǎn)基地。二、蝴蝶蘭病毒病種類和癥狀1.

56、病毒種類 蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物，因此與蘭科其他屬植物（6個亞科725屬約25000多個種）具有相同的病毒。 病毒病問題日趨嚴峻 世界范圍內(nèi)已報道從各種栽培蘭科植物中分離出至少25種病毒。Magee（1943）最早記載蘭科花卉病毒病。1900 年出版的蘭科植物圖譜上有類似齒蘭環(huán)斑病毒的癥狀。 蘭花病毒病分布情況差異極大，然而建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus， CymMV )和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV )幾乎遍及全世界，因此圍繞一些蘭科花卉病毒的研究工作最要緊集中于建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒。 據(jù)報道，目前國內(nèi)9

57、0蝴蝶蘭種苗帶有以上兩種病毒，臺灣生產(chǎn)的種苗有70帶毒，嚴峻阻礙到種苗質(zhì)量。Feritas-Astua(1999)等從在圣保羅（巴西）商貿(mào)農(nóng)場取得來自17個國家的1777個樣本用PTA-ELISA和電鏡檢測CyMV ，ORSV， CMV，CymRSV，VMV (vanilla mosaic)，得出CyMV、ORSV是要緊侵染蘭花病毒的，而沒有一個樣本感染了CMV， CymRSV和 VanMV。 鄭平等（1999）利用ELISA方法對426個熱帶蘭花品種檢測發(fā)覺了建蘭花葉病毒(CyMV)總感病率為38.0，齒舌蘭屬環(huán)斑病毒(ORSV) 總感病率為27.7，其中蝴蝶蘭、卡特利亞蘭、文心蘭兩種病毒感

58、病率均較高，石斛蘭感病率較低，對兩種病毒具較強的抗性；大花蕙蘭易感ORSV，感病率高達42.8。2、要緊病毒危害癥狀：（1） 建蘭花葉病毒(CyMV)： 屬于馬鈴薯X病毒屬，能使蘭科花卉產(chǎn)生褪綠斑點及壞死斑，蝴蝶蘭表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)病斑，到開花時，植株出現(xiàn)花朵畸形、花瓣缺、小花簇生于花梗同一部位等癥狀。病癥：植株經(jīng)常產(chǎn)生壞死病癥的傾向，如黑色壞死斑點、壞死條紋等。感病植株除葉部、莖部產(chǎn)生壞死外，花部也會產(chǎn)生壞死，這是CyMV病毒特有的病癥。壞死斑有時只出現(xiàn)于葉片下表面而不發(fā)生于上表面，也會產(chǎn)生黃綠斑駁的嵌紋或黃化條斑形病癥。另外也有部分蘭花種類感染后并不表現(xiàn)任何可辨認癥狀。 病毒特性及傳播方式：

59、CyMV在細胞外的穩(wěn)定性盡管不及煙草花葉屬（TMV）的病毒，但也是已知病毒中性質(zhì)極為穩(wěn)定的一屬。其顆粒體稍可彎曲，長度約為450nm，細胞外耐熱溫度為60至70，在室溫條件下可存活25天。 目前尚未發(fā)覺能夠傳播CyMV的媒介昆蟲，其傳播途徑由機械性傷口入侵及感染。（2）齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)： 屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，要緊危害齒蘭、建蘭、蝴蝶蘭等。蘭科花卉一旦感染ORSV，其葉片常產(chǎn)生黃化條紋或不規(guī)則褪綠色斑塊，病株花部甚至出現(xiàn)畸形或褪色斑，紅色系花朵褪色斑尤為明顯。能夠感染ORSV的蘭花種類超過20個屬以上。不同的蘭屬或蘭種所產(chǎn)生的病癥會有所差異。蝴蝶蘭、文心蘭、卡特蘭

60、等易被齒舌蘭環(huán)斑病毒感染，尤其是蝴蝶蘭。 齒蘭環(huán)斑病毒最早在文獻上記載的病癥是環(huán)斑，另外花葉、斑紋、黃化條紋、花色條斑等。在這些病癥中以花葉與斑紋最為常見。CyMV和ORSV復合感染同一蘭株的現(xiàn)象極為普遍，病癥會遠比單一病毒感染時嚴峻許多。能夠感染ORSV的蘭花種類超過20個屬以上。不同的蘭屬或蘭種所產(chǎn)生的病癥會有所差異。蝴蝶蘭、文心蘭、卡特蘭等易被齒舌蘭環(huán)斑病毒感染，尤其是蝴蝶蘭。 病毒特性及傳播方式： ORSV為煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的一種。顆粒體為短硬桿狀，長度約300nm。該屬病毒的共同特性是性質(zhì)極其穩(wěn)定，在寄主細胞外耐熱性強，在高達95的溫度下，仍可存活相當時日。本