皮質(zhì)骨I型膠原的提取及膠原明膠支架材料的制備

1、皮質(zhì)骨I型膠原的提取及膠原-明膠支架材料的制備【關(guān)鍵詞】組織工程膠原提取神經(jīng)支架Keyrds：tissueengineering;llagen;extratin;nervesaffld周?chē)窠?jīng)缺損后的修復(fù)再生和功能恢復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。由于周?chē)窠?jīng)構(gòu)造和功能上的特殊性，損傷后大多數(shù)情況下無(wú)法直接對(duì)拉吻合，自體神經(jīng)移植又有諸多限制，因此尋找一種神經(jīng)替代物來(lái)修復(fù)缺損是非常必要的。近年來(lái)，隨著組織工程技術(shù)的開(kāi)展，用于神經(jīng)修復(fù)研究的材料品種越來(lái)越多。目前型膠原蛋白制品為組織工程修復(fù)神經(jīng)研究中應(yīng)用較多的生物材料之一1。型膠原通常來(lái)自牛腱、鼠尾或皮膚，由于上述組織中含有大量其它種類(lèi)的膠原和非

2、膠原成分，提取及純化工藝復(fù)雜。骨中型膠原含量豐富，占骨基質(zhì)中有機(jī)成分的95以上，本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)的酶提取法加以改良，提取牛皮質(zhì)骨中I型膠原并制備神經(jīng)支架材料。1材料與方法1.1骨基質(zhì)粉的制備取新穎牛長(zhǎng)骨，去除軟組織、骨膜、骨端松質(zhì)骨及骨髓，然后將皮質(zhì)骨劈成骨塊，乙醇(60、70、80、90)梯度脫水，液氮冷凍后放入高速組織粉碎機(jī)中，粉碎為直徑0.62骨粉，持續(xù)攪拌下參加甲醇：氯仿(11，vv)脫脂48h，每24h換脫脂液1次;0.6lL鹽酸脫鈣84h，分別于第12、36、60h換脫鈣液，脫鈣完畢后去離子水洗滌3次備用。1.2膠原的提取將50g牛皮質(zhì)骨基質(zhì)粉浸在500l0.05lL冰醋酸和500g胃

3、蛋白酶混合溶液中，持續(xù)攪拌96h。待混合物變?yōu)闊o(wú)色、透明、粘稠液體后高速低溫離心20in(10000rin)，以去除未溶解雜質(zhì)。其上清即為液態(tài)粗制膠原。在上清中緩慢參加Nal，攪拌過(guò)夜，離心20in(15000rin)，去上清，沉淀物參加0.5lL冰醋酸溶解，離心20in(15000rin)，取上清參加5lLNaH調(diào)pH至7.3，緩慢參加Nal，攪拌過(guò)夜，離心20in(15000r/in)，去上清，沉淀物參加0.5lL醋酸中透析溶解，離心10in(15000r/in)，去沉淀，上清裝入透析袋中持續(xù)透析72h，每4h更換透析液1次。最終收獲無(wú)色透明粘性液體，濃縮凍干。以上液體及操作在47進(jìn)展。1

4、.3支架材料的制備稱(chēng)取樣品150g、明膠(Siga公司)75g溶于0.05lL冰醋酸溶液，4條件下攪拌90in(18000rin)，負(fù)壓抽真空后于4冰箱中過(guò)夜，充分混合成凝膠狀懸濁液后將其注入長(zhǎng)10、內(nèi)徑3的硅膠管中，密封兩端，順軸向以自制微型調(diào)速儀以210-5s的速度浸入冷凝劑中，將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預(yù)冷的鋁盤(pán)中，于-40、100Trr條件中凍干48h，制得枯燥成形的膠原蛋白支架材料2。材料用戊二醛交聯(lián)，60消毒密封備用3。1.4膠原的鑒定1.4.2將凍干樣品水解后，應(yīng)用Bekan121B型氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)展氨基酸分析。1.5支架材料內(nèi)部掃描電鏡觀察以掃描電鏡觀察上述制備的膠原蛋白支

5、架材料橫截面和縱切面并測(cè)量材料內(nèi)部微孔的直徑。2結(jié)果2.1選擇適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)換脫鈣液，持續(xù)脫鈣84h，可將骨粉中的鈣離子含量降到較低程度(圖1)。2.2膠原樣品鑒定結(jié)果2.2.1提取的樣品凍干后呈蓬松的白色海綿狀，具有吸潮性圖2。2.2.3最大光吸收波長(zhǎng)檢驗(yàn)結(jié)果樣品在230n波長(zhǎng)處顯示較強(qiáng)的光吸收，符合膠原特性。2.2.4樣品氨基酸分析結(jié)果甘氨酸占氨基酸總量的31.12%，羥脯氨酸占氨基酸總量的9.12%，脯氨酸占氨基酸總量的12.85%，羥脯氨酸與脯氨酸之比約0.71，氨基酸構(gòu)成比符合型膠原特性表1。表1皮質(zhì)骨磁針原氨基酸組成2.3掃描電鏡觀察結(jié)果支架材料外觀為外表封閉的圓柱狀構(gòu)造，電鏡下見(jiàn)縱切

6、面為軸向平行排列的微管構(gòu)造，橫切面上微管構(gòu)造呈內(nèi)徑均一的蜂巢狀分布，孔徑在20100，接近于坐骨神經(jīng)構(gòu)造圖4、5。3討論近年來(lái)，應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建種子細(xì)胞和具有良好生物相容性的支架材料復(fù)合體人工神經(jīng)修復(fù)外周神經(jīng)損傷成為研究的重點(diǎn)。人工神經(jīng)研究的關(guān)鍵之一在于如何選擇適宜的支架材料，以便復(fù)合種子細(xì)胞、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子從而更好的發(fā)揮促神經(jīng)再生作用。目前，以天然的細(xì)胞外基質(zhì)為原料制備支架材料成了研究的新方向。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，廣泛分布于骨、肌腱、韌帶、皮膚、軟骨等結(jié)締組織中，約占動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的1413，在細(xì)胞的分化、運(yùn)動(dòng)化趨向、結(jié)締組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)具有生物可降解性、低抗原

7、性、低毒性、能誘導(dǎo)細(xì)胞再生及易獲得性等諸多優(yōu)點(diǎn)，可參與組織愈合過(guò)程，在軟骨細(xì)胞再生誘導(dǎo)4、角膜移植5、人工皮膚制備6等方面得到廣泛應(yīng)用，應(yīng)用在周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)中亦能刺激改善神經(jīng)的再生7。圖1鈣離子濃度變化圖2凍干樣品圖3樣品電泳圖譜圖4掃描電鏡下觀察支架材料橫切面400圖5掃描電鏡下觀察支架材料縱切面200以往膠原的提取多集中在相對(duì)易于處理的牛腱、豬皮和鼠尾腱。由于膠原是一個(gè)大的蛋白家族，從上述組織中提取時(shí)分型、純化難度較大，程序復(fù)雜，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，易導(dǎo)致膠原變性。骨膠原的提取純化報(bào)道較少，而骨中有機(jī)質(zhì)90以上為膠原，主要為I型膠原，有望作為制備I型膠原的重要來(lái)源。作者將傳統(tǒng)的酶溶解法加以改良

8、應(yīng)用于骨膠原的提取，在骨粉顆粒直徑、脫脂脫鈣時(shí)間、酶促溶解、抽提次數(shù)等方面加以細(xì)化，省去分型、純化等冗長(zhǎng)程序，耗時(shí)較短，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。I型膠原的氨基酸組成中，甘氨酸約占氨基酸總量的13;含有羥賴(lài)氨酸和羥脯氨酸，一般蛋白質(zhì)中那么不存在羥賴(lài)氨酸，羥脯氨酸也很少見(jiàn);羥脯氨酸與脯氨酸之比約為0.70.8。本實(shí)驗(yàn)樣品膠原氨基酸分析符合I型膠原的組成特征，最大光吸收波長(zhǎng)在230n附近，電泳分析其區(qū)帶與I型膠原標(biāo)準(zhǔn)品區(qū)帶一樣。結(jié)果顯示，作者通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了純度較高的I型膠原。作者以實(shí)驗(yàn)獲得的I型膠原和明膠為主要原料，構(gòu)建了具有微管排列構(gòu)造的支架材料，其內(nèi)徑在20100，三維構(gòu)造上接近于坐骨神經(jīng)，具有一定的仿生效果。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明8，