熱休克蛋白與疾病課件

1、Heat Shock Proteins and DiseasesDept. of Pathophysiology, Xiangya School of Medicine, CSUKangkai Wang09-026-2012 CHANG SHAContentsI. Introduction of HSPs 1. Definition of HSPs 2. Characteristic 3. Classfication and distribution within cell 4. Functions 5. Regulation of expression II. HSPs and heart

2、disease III. HSPs and atherosclerosis IV. HSPs and inflammation V. HSPs and tumor VI. HSPs and aging VII. Perspective on translation medicine 1、對環(huán)境變化做出反應是生物細胞的基本特征及生存的必要條件。2、生物細胞在高溫環(huán)境下所表現(xiàn)的以基因表達變化為特征的反應稱熱休克反應（heat shock response, HSR），所產生的一組蛋白質叫熱休克蛋白（heat shock protein, HSP）。3、除了熱休克外，許多其它理化及生物刺激都可誘導H

3、SP的產生，故HSP又稱為應激蛋白（stress protein, SP）。 一、基本概念Ritossas puffs, 1962三、HSP的分類及細胞內分布 主要HSP家族成員 分子量細胞內定位可能的生物學功能HSP110亞家族110000 HSP110核仁,胞漿熱耐受,交叉耐受 HSP105胞漿蛋白質折疊HSP90亞家族90000 HSP90(HSP86)胞漿與類固醇激素受體結合,熱耐受 HSP90(HSP84)胞漿與類固醇激素受體結合,熱耐受 Grp94內質網分泌蛋白質的折疊HSP70亞家族70000 HSC70(組成型)胞漿蛋白質折疊及移位 HSP70(誘導型)胞漿,核蛋白質折疊,細胞

4、保護作用 HSP75線粒體蛋白質折疊及移位 GRP78(Bip)內質網新生蛋白質折疊HSP60亞家族60000 HSP60線粒體蛋白質的折疊 TriC胞漿蛋白質的折疊 HSP4747000 內質網膠原合成的質量控制 HSP40( hdj-1)胞漿蛋白質折疊小分子HSP亞家族2000030000 HSP32(HO-1)胞漿 HSP27胞漿,核肌動蛋白的動力學變化 B-晶狀體蛋白胞漿細胞骨架的穩(wěn)定 HSP1010000線粒體為HSP60的輔因子 泛素(ubiquitin)8000胞漿,核蛋白質的非溶酶體降解四、HSP的功能分子伴侶 （molecular chaperone） 1、幫助新合成蛋白質的

5、折疊，防止其互相聚集2、幫助蛋白質的細胞內移位3、幫助變性蛋白質的復性4、清除嚴重受損的蛋白質Substrate loading complex for the HSP90 system HSP90 (orange), HSP70 (light orange), HSP40 (yellow), HOP (blue), and client substrate (red) 泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasome pathway） 泛素為分子量8kd的HSP，促進異常蛋白質 在蛋白酶體中降解。 包括：不完全的蛋白質，誤折疊的蛋白質（由于基因突變等），變性的蛋白質，多亞基復合物

6、的游離亞基，不能結合輔因子的蛋白質，氧化損傷的蛋白質，不能在ER中折疊的膜蛋白或分泌蛋白，錯誤導向的蛋白質。 五、HSP表達的調控 1、組成型表達(constitutive expression): 涉及HSP基因5端調控區(qū)的普通啟動子及組織特異性啟動子等，其調控機制至今仍不十分清楚。2、誘導表達(inducible expression): 主要通過熱休克因子（HSF）調控。 一）、轉錄水平調控3、HSF家族 酵母HSF（為存活所必須） 果蠅HSF（與存活及生長無關，但為卵 細胞發(fā)生及幼蟲發(fā)育所必須） 雞 HSF13 小鼠HSF12, HSF4 人 HSF12，HSF4二）、轉錄后水平調控1

7、、mRNA穩(wěn)定性Protein-RNA interaction: nucleolinRNA binding element: (T/G)CCCG(A/G) within the 5 or 3 UTR or the ORF region of the target genes.AA1-309 AA 310-713Methods for Detecting the expression of target genes and the interaction between nucleolin and mRNA :After inhibition of transcription with acti

8、nomycin D Western blot RT-PCR OR real time PCRInteraction assay RNA-EMSA RNA-IP and RT-PCR Reporter gene analysisSangupta TK: JBC,2004, 279(12):10855-63RNA-EMSA RNA-IP and IB Cancio-Lonches C: J Virol. 2011;85(16): 80568068. GenesC23-binding sequenceSitesHsp70(U/G)CCCG(A/G)5UTR及3UTRBcl-2(U/G)CCCG(A/

9、G)5UTR及3UTRHsp32(HOX1)(U/G)CCCG(A/G)5UTR及3UTRHsf1GCCCGG編碼區(qū)Bmp4(U/G)CCCG(A/G)3UTRHSP90(U/G)CCCG(A/G)5UTR及編碼區(qū)COX-2GCCCGG編碼區(qū)及3UTRNAIP/BIRC1GCCCGG3UTRMCL1GCCCGG/GCCCGA編碼區(qū)Bioinformatics analysis for the genes containing the nucleolin binding motif within the mRNA moleculesNucleolin 與HSP70 mRNA 3-UTR直接結合，

10、增加其穩(wěn)定性 RNA-RNA interaction: microRNA2、mRNA翻譯受抑 microRNA完全互補 植物miRNA 部分哺乳類miRNA 不完全互補 哺乳類miRNA Western Blot， RT-PCR Western Blot3、翻譯后修飾磷酸化泛素化Ischemia 30/ Reperfusion 24 harea at risk (AAR); infarct-to-risk region ratio Qian J. Circ Res. 2009;105(12):1223-31 ContentsI. Introduction of HSPs 1. Definiti

11、on of HSPs 2. Characteristic 3. Classfication and distribution within cell 4. Functions 5. Regulation of expression II. HSPs and heart disease III. HSPs and atherosclerosis IV. HSPs and inflammation V. HSPs and tumor VI. HSPs and aging 熱休克蛋白與心臟疾病細胞保護心肌保護：外源性保護 內源性保護：缺血預適應 熱休克蛋白心肌內源性保護概念的提出： 1986，Mur

12、ry發(fā)現(xiàn)缺血預適應（ischemic preconditioning）； 1988，Currie發(fā)現(xiàn)經熱休克預處理后，大 鼠心肌缺血-再灌注損傷減輕。 改變HSP70水平的方法心肌損傷模型 保護作用 參考文獻熱休克 大鼠離體心I/R 超微結構,心功能,酶釋放Currie RW,1988心肌缺血,熱休克 大鼠在體心I/R 心肌力學,梗塞面積 Donnelly TJ,1992基因轉染 小鼠心肌細胞,缺氧 細胞膜損傷,酶釋放 Williams RS,1993基因轉染 H9C2細胞,缺氧 細胞存活率,LDH釋放 Mestril R, 1994轉基因小鼠 離體心I/R 心肌力學, Plumier JC,

13、1995能量代謝 Radford NB,1996梗塞面積 Hatter JJ,1996基因轉染(HSC70) H9C2,氧化應激 膜脂質過氧化,酶釋放 Chong KY, 1998腺病毒心肌內注射 家兔在體心I/R 梗塞面積 Okubo S,2001病毒脂質體,冠脈內 大鼠離體心I/R 心肌力學,酶釋放 Jayakumar J,2000凋亡 Suzuki K,2000HSP70的心肌保護作用研究 HSP70 對H2O2 所致心肌細胞核仁損傷的保護作用HSR+H2O2CtrlHSRFig 2-7. Effects of HSR on nucleolar segregation induced b

14、y oxidative stress ( 1020).H2O2Ctrl H2O2 3 h HSR+H2O2 3 h HSR Fig2-11. Effect of HSR on the nucleolar segregation in HSF1+/+ MEFs.Fig2-12. Effect of HSR on the nucleolar segregation in HSF1-/- MEFs.Ctrl HSR H2O2 3 h HSR+ H2O2 3 h pcDNA3.1- HSP70WT, HSP70NLS pEGFP- HSP70WT, HSP70NLS pcDNA3.1(-)HSP70W

15、TCtrlH2O23 hHSP70NLSHSP70 inhibited H2O2mediated nucleolar segregation in C2C12 cellsCtrl H2O2 HSP70WT HSP70NLS B D A C Fluorescent microscopy showing the intracellular distribution of HSP70WT and HSP70NLSHSP60/HSP10： 1、H9C2細胞腺病毒介導HSP60/HSP10基因轉染 缺氧酶釋放，存活率（必須兩者同時轉染 才有效） （Lau S et al,1997) 2、腺病毒介導基因轉

16、染新生大鼠心肌細胞HSP60/HSP10過表達缺氧-再給氧保護作用 壞死(酶釋放) 凋亡(Cyt C 釋放,Caspase-3,DNA降解) （Lin KM et al,2001）HSP32(heme oxygenase-1, HO-1) 血紅素氧合酶是催化血紅素分解成膽綠素、膽紅素及CO的限速酶。 基因5調控區(qū)含HSE，受HSF調控，在氧化應激時誘導表達。 CO Iron NADP HO-1 Heme Biliverdin（膽綠素） Biliverdin reductase NADPHNADHO2NADPHBilirubin（膽紅素）NADP NAD1、大鼠心臟 缺血-再灌 HSP32表達

17、大鼠血紅素注射（i.p） 心肌中HSP32（2.8倍）I/R梗塞面積（如同時給予HO-1抑制劑，則保護作用被取消） （Hangaishi M et al, 2000）2、小鼠基因敲除模型破壞一個HO-1基因 HO-1（+/-）小鼠離體心I/R心肌力學恢復差，CPK釋放，梗塞面積 （Yoshida T et al, 2001） 24hr48hr小分子HSP： 分子量2030kD： HSP 27/25 B-晶狀體蛋白（HSP22） A-晶狀體蛋白 HSP20 MKBP/HSPB2 HSPB3 特點： 1、C-末端含有共同的“-晶狀體蛋白核心結構域”； 2、在橫紋肌中表達水平高，與胚胎期橫紋肌的分化

18、 關系密切； 3、與細胞骨架關系密切。 小分子HSP的心肌保護研究 1、大鼠心肌缺血HSP27/25、B-晶狀體蛋白及MKBP從胞漿向肌原纖維移位，主要分布于閏盤、Z線等處 （Yashida K et al, 1999） 2、大鼠、豬心肌缺血BC的移位伴隨有磷酸化 （Golenhofen N et al, 1998） 3、L929細胞，H2O2損傷HSP27/25的分子伴娘及細胞保護作用與其磷酸化狀態(tài)及細胞中谷胱甘肽水平升高有關（Rogalla T et al, 1999; Preville X et al, 1998） 可跨膜運轉的B-晶狀體蛋白工程蛋白質的制備及其對心肌細胞損傷的保護作用p

19、GEX-MTS-BCpGEX-MTSpF14GGSTMTSFactor XaEcoR IEcoR IEcoR IBCGSTMTSFactor XaBCAB1 2 3 4 512kb321.610.50.40.30.20.1BC載體構建 AB45.7KD32.5KD18.4KD1 2 3 4 5 61 2 3GST-MTS-BC GST MTS-BC GST-MTS-BC MTS-BC 78KDABCCell death rate (%)LDH release (%)*#*#4、新生大鼠心肌細胞腺病毒介導BC基因轉染模擬缺血CPK釋放，微管結構損傷 （Dillmann WH et al, 199

20、9）5、BC轉基因小鼠工作心臟缺血20min，再灌3hr心功能改善，梗塞面積，凋亡 （Ray PS et al, 2001） 熱休克蛋白對心肌細胞凋亡的影響B(tài)CHSP60HSP27HSP70Other Pathways(From: Kamradt et al,2001;Bruey et al,2000;Pandey et al 2000;Lin et al,2001;Xanthoudakis et al 1999;Sumli et al,1999;Mosser et al,2000;Saleh et al,2000;Nylandsted et al,2000;Pandey et al,2000

21、;Park et al,2001)HSP90?pcDNA3.1+H2O2(12h) Smac+H2O2(12h)HSP70+H2O2(12h)HSP70+Smac+H2O2 (12h)*#*#2 22 22 2 2 2 Fig.7. Effect of HSP70 or Smac overexpression on the percentage of apoptotic nuclei induced by H2O2. HSP70的蛋白質相互作用網絡及其心肌保護作用研究ContentsI. Introduction of HSPs 1. Definition of HSPs 2. Charact

22、eristic 3. Classfication and distribution within cell 4. Functions 5. Regulation of expression II. HSPs and heart disease III. HSPs and atherosclerosis IV. HSPs and inflammation V. HSPs and tumor VI. HSPs and aging 熱休克蛋白與動脈粥樣硬化HSP70：在單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和平滑肌細胞中高表達。HSP60： 動脈粥樣硬化斑塊形成早期最重要的自身抗原。Schematic re

23、presentation of the role of autoimmune responses to HSP60 in atherosclerosis.ContentsI. Introduction of HSPs 1. Definition of HSPs 2. Characteristic 3. Classfication and distribution within cell 4. Functions 5. Regulation of expression II. HSPs and heart disease III. HSPs and atherosclerosis IV. HSP

24、s and inflammation V. HSPs and tumor VI. HSPs and aging 熱休克蛋白與炎性疾病HSP在腦膜炎中的表達PM：化膿性腦膜炎；TM：結核性腦膜炎；VM：病毒性腦膜炎1. 細胞內熱休克蛋白2. 細胞外熱休克蛋白細胞內熱休克蛋白與炎性疾病HSP72對晚期炎癥介質HMGB1釋放和功能的影響細胞外熱休克蛋白與炎性疾病抗原呈遞作用自身抗原：動脈粥樣硬化(a) lysis of the cell of origin;(b) release in vesicles by a blebbing mechanism followed by subsequent l

25、ysis of vesicles ;(c) secretion through an endolysosomes and release when the endolysosome fuses with the cell surface.Hsp70 receptorsCD91：2巨球蛋白受體，存在于多種免疫細胞 CD40：選擇性識別HSP70 LOX-1：氧化低密度脂蛋白受體，促進單核細胞與HSP70的結合Effects of heat shock proteins on dendritic cells, and induction of peptide-specific immunityCo

26、ntentsI. Introduction of HSPs 1. Definition of HSPs 2. Characteristic 3. Classfication and distribution within cell 4. Functions 5. Regulation of expression II. HSPs and heart disease III. HSPs and atherosclerosis IV. HSPs and inflammation V. HSPs and tumor VI. HSPs and aging 熱休克蛋白與腫瘤Implications in

27、 Diagnosis(診斷)Table 1. Heat shock proteins in Breast cancer: diagnostic implicationsHspFindingsHsp27Correlation with estrogen receptors; Overexpression: low cell proliferation; Lack of association with ER in male BC; Smears, suspicious of malignancyHsp70Hsp70 and c-myc: in 63% of carcinomas; Associa

28、ted with elevation of ER; High cell proliferation; LN metastasis, poor differentiationHsp90Overexpression: LN involvementAssociation with PR isoformsHigher: cancer, correlated with cyclin D1Table 2. Heat shock proteins in Endometrial cancer: diagnostic implicationsHspFindingsHsp27Increased in hyperp

29、lastic endometrium;Overexpression in low-grade endometrial stromal sarcomas; negative: high grade;Antibodies: detected in cancer patientsHsp70Poor differentiationHsp90Overexpression: well differentiationDiagnostic implication(診斷指標)autoantibodies to certain Hsps are of significance as tumor markers i

30、n osteosarcomas, ovarian cancer, et alCarcinogenesis(腫瘤發(fā)生)Hsp expression levelscan help indicate the presence of abnormal changes during the process of carcinogenesis (in certain tissues).Differentiation(分化程度)expression correlates with the degree of differentiation in certain tissues.Associations wi

31、th other moleculesseveral Hsps are coexpressed in cancer tissues; certain Hsps can be significantly associated with other molecules.熱休克蛋白與腫瘤Implications in the Prognosis(預后)Hsp27預后不好: 乳腺癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌預后良好：食管癌、胰腺癌、腎癌、黑色素瘤無判斷預后價值：頭頸部鱗癌、白血病Hsp70預后不好: 卵巢癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、 骨肉瘤預后良好：子宮內膜癌、食管癌、惡性皮膚纖維瘤無判斷預后價值：口

32、癌、頭頸部鱗癌、白血病Hsp90預后不好: 乳腺癌預后良好：子宮內膜癌、膀胱癌無判斷預后價值：卵巢癌、口癌熱休克蛋白與腫瘤Predictive Implications（治療反應預測）Tamoxifen：它莫西芬，一種抗雌激素；Bccl：bladder carcinoma cell line; C：chemotherapy; Scc：squamous cell carcinoma; H：hyperthermia; nsclc, nonsmall cell lung carcinoma; R：radiotherapy.熱休克蛋白與腫瘤Implications in the Treatment（治療）Agents that modify the molecular levels or molecular capabilities of