凝膠的選擇、處理和保存

1、PAGE 1PAGE 凝膠的選擇、處理和保存 1. 凝膠的選擇 通過(guò)前面的介紹可以看到凝膠的種類、型號(hào)很多。不同類型的凝膠在性質(zhì)以及分離范圍上都有較大的差別，所以在進(jìn)行凝膠層析實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)樣品的性質(zhì)以及分離的要求選擇合適的凝膠，這是影響凝膠層析效果好壞的一個(gè)關(guān)鍵因素。一般來(lái)講，選擇凝膠首先要根據(jù)樣品的情況確定一個(gè)合適的分離范圍，根據(jù)分離范圍來(lái)選擇合適型號(hào)的凝膠。一般的凝膠層析實(shí)驗(yàn)可以分為兩類：分組分離（group separations）和分級(jí)分離（fractionations），分組分離是指將樣品混合物按分子量大小分成兩組，一組分子量較大，另一組分子量較小。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液

2、去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等。分級(jí)分離則是指將一組分子量比較接近的組分分開(kāi)。在分組分離時(shí)要選擇能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，這樣分離效果好。一般常用排阻極限較小的凝膠類型。分級(jí)分離時(shí)則要根據(jù)樣品組分的具體情況來(lái)選擇凝膠的類型，凝膠的分離范圍一方面應(yīng)包括所要的各個(gè)組分的分子量，另一方面要合適，不能過(guò)大。如果分離范圍選擇過(guò)小，則某些組分不能得到分離；如分離范圍選擇過(guò)大，則分辨率較低，分離效果也不好。選擇凝膠另外一個(gè)方面就是凝膠顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對(duì)流速慢，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)造成擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重；顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當(dāng)也可以得到滿意的結(jié)果。選

3、擇時(shí)要依據(jù)分離的具體情況而定，例如樣品中各個(gè)組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達(dá)到分離的目的；如果有個(gè)別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。由于凝膠一般都比較穩(wěn)定，所以它在一般的實(shí)驗(yàn)條件下都可以正常的工作。如果實(shí)驗(yàn)條件比較特殊，如在較強(qiáng)的酸堿中進(jìn)行或含有有機(jī)溶劑等等，則要仔細(xì)查看凝膠的工作參數(shù)，選擇合適的類型的凝膠。 2. 凝膠的處理 凝膠使用前要首先要進(jìn)行處理。選擇好凝膠的類型后，首先要根據(jù)選擇的層析柱估算出凝膠的用量。由于市售的葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠通常是無(wú)水的干膠，所以要計(jì)算干膠用量：干膠用量（g）柱床體積（ml）/ 凝膠的床體積（ml / g）。 由于

4、凝膠處理過(guò)程以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能有一定損失，所以一般凝膠用量在計(jì)算的基礎(chǔ)上再增加1020。 葡聚糖凝膠和丙烯酰胺凝膠干膠的處理首先是在水中膨化，不同類型的凝膠所需的膨化時(shí)間不同。一般吸水率較小的凝膠（即型號(hào)較小、排阻極限較小的凝膠）膨化時(shí)間較短，在20 C條件下需34小時(shí)；但吸水率較大的凝膠（即型號(hào)較大、排阻極限較大的凝膠）膨化時(shí)間則較長(zhǎng)，20 C條件下需十幾個(gè)到幾十個(gè)小時(shí)，如Sephadex G-100以上的干膠膨化時(shí)間都要在72小時(shí)以上。如果加熱煮沸，則膨化時(shí)間會(huì)大大縮短，一般在15小時(shí)即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但應(yīng)注意盡量避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。瓊脂糖凝膠和有些市售凝膠是水懸浮的狀態(tài)，所以不需膨化處理。另外多孔玻璃珠和多孔硅膠也不需膨化處理。 膨化處理后，要對(duì)凝膠進(jìn)行純化和排除氣泡。純化可以反復(fù)漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的細(xì)小凝膠顆粒。也可以一定的酸或堿浸泡一段時(shí)間，再用水洗至中性。排除凝膠中的氣泡是很重要的，否則會(huì)影響分離效果，可以通過(guò)抽氣或加熱煮沸的方法排除氣泡。 3. 凝膠的保存 凝膠的保存一般是反復(fù)洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當(dāng)?shù)目咕鷦?，通常加?.02的疊氮化鈉，4 C下保存。如果要較長(zhǎng)時(shí)間的保存，則要將凝膠洗滌后脫水、干燥，可以將凝膠過(guò)濾抽干后浸泡在50的乙醇中脫水，抽干后再