-高效液相色譜法

1、高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography （HPLC）1一、前言 HPLC是70年代以后發(fā)展最快的一個分析化學(xué)分支，現(xiàn)已成為生化、醫(yī)學(xué)、藥物臨床、化學(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保檢測等領(lǐng)域最常用的分離分析手段。我國：2課時安排：第一章：高效液相色譜的基本原理 6學(xué)時第二章：高效液相色譜的儀器裝置 2學(xué)時第三章：液固、液液、鍵合相色譜 4學(xué)時第四章：離子交換色譜和離子對色譜 3學(xué)時 第五章：凝膠滲透色譜 1學(xué)時第六章：實驗技術(shù)和輔助實驗技術(shù) 2學(xué)時機動 2學(xué)時3實驗安排：實驗一：樣品保留值的重復(fù)性測定實驗二：流動相極性變化對溶質(zhì)保留值的影響實驗三：試樣中

2、苯甲酸的定性分析4參考書籍：1.色譜理論基礎(chǔ)（盧佩章、戴朝政編）2.高效液相色譜法（鄒漢法、張玉奎、盧佩章編著）3.高效液相色譜方法及應(yīng)用 （色譜技術(shù)叢書、化學(xué)工業(yè)出版社、 于世林編著)5第一章、高效液相色譜的基本原理1-1 概述一、發(fā)展歷史1903年提出、19691970年開始發(fā)展流動相液體基本原理：在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入 氣相色譜理論技術(shù)：采用高效固定相、高壓泵、高靈敏檢測器實現(xiàn)：分析速度快、分離效率高、操作自動化678 工作原理： 通過高壓泵，連續(xù)地將流動相按一定流速流過柱子；通過進(jìn)樣器，注入樣品混合物。由于混合物中各組分性質(zhì)不同，因而它們在柱內(nèi)移動速度不同而逐漸分離。通過檢測器檢測

3、，得到組分的電信號并進(jìn)行放大；記錄儀將放大的電信號以圖形形式記錄下來。 9高效液相色譜法特點：1.高壓：一般：150300kg/cm2 甚至：500kg/cm22.高速：兩相間交換：千分之幾秒 分析時間較經(jīng)典法少很多(幾分幾十分鐘)3 高效：氣相：2000塔板/米 液相：5000塔板/米4.高靈敏度：紫外檢測器：109g數(shù)量級 熒光檢測器：1011g(百萬分之幾） 試樣量?。◣孜⑸?.高選擇性：可分析在性質(zhì)上極為相似化合物 （手性化合物、同位素、同分異構(gòu)、空間異構(gòu)） 10與氣相色譜比較：相同點：都是重要的分離、分析手段 氣相的基本理論（塔板理論、定性定量方法） 基本術(shù)語（色譜參數(shù)、色譜圖、色

4、譜柱效）不同點：應(yīng)用范圍：氣相：易揮發(fā)、熱穩(wěn)定 液相：不易揮發(fā)、熱不穩(wěn)定但具有一定 溶解性化合物，不適合氣體。流動相作用：氣相：運載樣品，不影響色譜分離 液相：運載樣品，參與、影響色譜分離， 且起主要作用。分析樣品：氣相：破壞樣品，不能回收。 液相：不破壞樣品，能回收。說明：11 HPLC的分類： 液固吸附色譜（LSC) （ 利用樣品分子在固定相上吸附性能差異而分離） 液液分配色譜（LLC）（利用樣品分子在兩相中分配系數(shù)不同導(dǎo)致溶解度不同而分離） （鍵合相色譜 60） 離子交換色譜（IEC）（利用樣品分子的電荷性、導(dǎo)電性不同，導(dǎo)致對固定相的親合力不同而分離） 體積排阻色譜（SEC)（利用溶質(zhì)分

5、子大小不同導(dǎo)致對固定相的滲透力不同而分離）121-2 色譜分離和保留值一、色譜過程定義由于樣品中各組分在不互溶的兩相間平衡 分配的不同，在色譜柱中進(jìn)行分離的過程 固定相：柱中固定不動 移動相：流過柱子的液體綜合來看：不同組分分離狀況取決于：熱力學(xué)平衡問題：各組分分配系數(shù)、吸附力、親 合力之間差異影響出峰時間動力學(xué)平衡問題：溶質(zhì)擴散系數(shù)、填料顆粒、填 充情況、流速影響峰形13色譜過程特點：組分經(jīng)無數(shù)次平衡分配后，在柱的流 出液中濃度對分離時間呈高斯曲線型色譜條件一定時，各組分都有特定時 間在圖譜中出現(xiàn)，稱為保留時間tR。柱效一定時，保留值越小，峰窄；保 留值越大，峰寬。相鄰峰間tR相差越大，組分

6、間越易分 離14二、容量因子和保留值 色譜的保留作用化合物進(jìn)入柱內(nèi)，即在兩相間不斷進(jìn)行平衡分配，由于不同化合物理化性質(zhì)不同，在兩相中存在量也不同。固定相中量多，柱內(nèi)保留時間長；流動相中量多，柱內(nèi)保留時間短。15容量因子k某一組分平衡時，兩相中存在量的比值。要得到理想分離， k應(yīng)保持在110之間 k太小沒有充分利用填料 的分離能力。 k太大分析時間太長。1613色譜柱的分離效率分離過程基本理論：各組分在兩相間分配情況：tR由色譜過程的熱力學(xué)因素所控制各組分在色譜柱中的運動情況：Y1/2由色譜過程的動力學(xué)因素所控制17一、理論塔板數(shù)N二、理論塔板高度H三、峰擴展和速率方程式峰擴展某一組分流過時，經(jīng)

7、過多次平衡分配，使開始處于“濃縮”狀態(tài)的組分被移動相稀釋，最后得到有一定寬度的色譜峰，稱之。柱外因素：檢測器流動池體積 柱出口到檢測器的連接管 進(jìn)樣器死體積18柱內(nèi)峰擴展影響因素：渦流擴散減小措施：顆粒大小保持一致 填裝均勻 盡量采用球型填料渦流擴散隨柱長增加而增加，與流動相流速無關(guān)。分子擴散減小措施：加大流動相流速19傳質(zhì)溶質(zhì)分子在兩相間濃度的不同，從濃度高的相，不斷遷移至濃度低的相，直到濃度達(dá)到平衡，這種質(zhì)量遷移過程稱之。固定相傳質(zhì)：固相固定相 液相固定相移動相傳質(zhì)：遷移移動相 滯留移動相20獲得高柱效的幾種方法：選用細(xì)的顆粒填料流動相流速低流動相粘度小升高溫度溶質(zhì)擴散系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān)大分

8、子，擴散系數(shù)小小分子，擴散系數(shù)大212214 分離度 Rs（Resolution)一、分離度影響因素峰的寬度（峰寬越小， Rs越大） 峰的寬窄主要反映了色譜分離的動力學(xué)特性兩峰的保留時間之差（tR越大， Rs越大） 反映了色譜分離的熱力學(xué)特性二、控制分離度方法改變k更換色譜柱（改變N）改變選擇性系數(shù)三、分離度控制的一般原則23第二章 儀器裝置液相色譜儀可分為四大系統(tǒng)： 泵系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 2421 泵系統(tǒng)作用：向色譜柱輸送一個連續(xù)、恒定的移 動相。一、對泵系統(tǒng)的要求1.使用方便（易調(diào)節(jié)流量、過壓保護(hù)等）2.更換洗脫液容易、死體積小3.有最大工作壓力4.一定流量范圍（0.110

9、ml/min)5.流量穩(wěn)定性好6.流量精度高25泵系統(tǒng)26泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢高效：填料顆粒分離效率 柱壓降泵的工作壓力分析時間短：更快流速柱壓降減少洗脫液用量液相色譜的多元洗脫系統(tǒng)2722 分離系統(tǒng)（色譜柱）組成：精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭要求：柱管內(nèi)壁非常光滑 柱接頭設(shè)計要保證系統(tǒng)中引入最小 死體積 能密封高壓液體 兩端加過濾片28柱效的影響因素填料的顆粒度及其均勻性柱長、填裝的方法與技巧常用：內(nèi)徑25mm（4.6mm)柱效一定時，柱長與顆粒度成正比例如：顆粒度510um、柱長1530cm 顆粒度35um、 柱長7.515cm29進(jìn)樣系統(tǒng)302-3 檢測系統(tǒng)功能：連續(xù)地將色譜柱中流出的組分

10、隨時間 變化的情況，轉(zhuǎn)變成大小不同的電信 號輸入到記錄儀中，得到色譜圖。按檢測方式不同，分為：總體性質(zhì)檢測器（通用型） 示差折射檢測器、電導(dǎo)檢測器溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型） 紫外檢測器、熒光檢測器31一、檢測器的性能指標(biāo)一個理想檢測器，必須具備下列條件：靈敏度高不受溫度及流動相流速變化的影響響應(yīng)隨組分量的變化而線性地變化穩(wěn)定性好，操作方便32性能指標(biāo)：靈敏度 S=R/Q最小檢測限（檢測下限）線性范圍檢測信號呈線性變化時，最 大和最小進(jìn)樣量之比噪音在沒有樣品情況下，檢測器輸出 的最大振幅漂移檢測器在一段時間內(nèi)，基線隨時 間的增加而產(chǎn)生的偏離33檢測系統(tǒng)34紫外檢測器優(yōu)點：靈敏度高（1010g/ml

11、)對梯度洗脫是一種理想檢測器局限性：不能檢測對紫外光沒有吸收的樣品不能使用對紫外光有吸收的溶劑35PAD檢測器36第三章、液固色譜、液液色譜、鍵合相色譜31 液固吸附色譜一、原理: 固定相是極性吸附劑，由于不同官能 團樣品具有不同極性，因而對固定相的吸 附能力不同。極性越大，吸附能力強；極 性越低，吸附能力越弱而導(dǎo)致分離。37分離對象：官能團有差別的不同類型化合物幾何異構(gòu)體（由于固定相表面是剛性結(jié)構(gòu)，即吸附中心處于吸附劑表面一定位置上。溶質(zhì)分子官能團與吸附中心的相互作用隨分子的幾何形狀而改變，當(dāng)官能團與吸附中心對準(zhǔn)，作用就強。）38二、填料的類型及其選擇按形狀分：a. 球形 b. 無定形按多孔

12、程度分：a. 多孔型 b. 薄殼型按極性分：a. 極性 b.非極性三、硅膠的活性控制及標(biāo)準(zhǔn)化市售未處理硅膠加熱46小時，活化去水。再加進(jìn)定量水分，使吸附劑含水量保持恒定。39四、吸附強度分類根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)類型，可將它們在硅膠上 的吸附強度排序：P186歸納：官能團不同極性不同吸附強度不同幾何異構(gòu)體空間位置不同吸附強度不同40五、流動相選擇的實用要求溶劑的純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)溶劑流動相應(yīng)與檢測器相匹配使用的溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去，不干擾對分離組分的回收41LSC流動相分類根據(jù)所起作用分為：底劑 洗脫劑根據(jù)氫鍵、酸堿性基團分類：無氫鍵型 斥電子氫鍵

13、型吸電子氫鍵型 具斥、吸電子雙重性的氫鍵型 酸類 堿類42LSC流動相的選擇流動相作用：把吸附劑吸附的溶質(zhì)洗脫下來溶劑強度。洗脫能力k 溶劑強度參數(shù)。序列：P174混合溶劑優(yōu)點：獲得最佳分離選擇性移動相粘度低4332 液液分配色譜和鍵合相色譜一、液液分配色譜（LLC)定義以一種液體作固定相，它均勻 地涂敷在大小一致的小顆粒惰性 擔(dān)體上。另一種液體作移動相。涂 敷在擔(dān)體上的固定相應(yīng)與移動相 極性有很大差別，即兩者不相溶。441. 原理：溶質(zhì)分子X在固、液兩相中存在分配平衡KXS/Xm，不同的溶質(zhì)在兩相中有不同的分配系數(shù)K，因而在兩相中有不同的溶解度。在固定相中溶解度大，tR；在移動相中溶解度大，

14、 tR。452. 固定相要求：溶質(zhì)在固定相中溶解度大于移動相防止固定相流失很重要，采取措施：移動相使用前，先預(yù)飽和。避免使用對固定相有中等溶解度的移動相整個色譜體系的穩(wěn)度必須恒定注意配制樣品溶液的溶劑特性46注意點：對有不同長度側(cè)鏈的多環(huán)芳烴，宜用反相色譜分離。在相同條件下，流動相組分變化對有取代基的多環(huán)芳烴的保留影響較大。3.流動相選擇對固定相無損害不宜采用梯度洗脫常見：乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷47二、鍵合相色譜定義固定相通過某種化學(xué)反應(yīng)將有機分 子以共價鍵結(jié)合在色譜擔(dān)體的表面， 這種色譜類型稱之。制備硅膠基質(zhì)化學(xué)鍵合固定相，注意：鍵合反應(yīng)前，將硅膠表面硅氧烷全部水 解為硅烷醇。除去

15、硅膠表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。48形成化學(xué)鍵合固定相，必須具備條件： 所用基質(zhì)材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性 有能與基質(zhì)表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的官能 團鍵合相反應(yīng)類型：P303目前最廣泛采用的化學(xué)鍵合固定相：硅烷化合物（存在Si-C鍵）使反相色譜的應(yīng)用范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正相色譜49反相色譜的保留機理疏溶劑理論雙保留機理分離對象：同系物：烷烴數(shù)tR 直鏈tR支鏈tR化合物極性 tR固定相對組分保留的影響：碳鏈長度：碳鏈 tR烷基覆蓋量：覆蓋量 tR50反相色譜中流動相選擇水有機改善劑常用：甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán)極性：有機改善劑水洗脫能力：有機改善劑水極性順序：甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃洗脫順序：

16、水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃51反相鍵合相色譜的優(yōu)點流動相可選用水溶性 .樣品的溶解度范圍提高 .流動相可變性大 .柱重現(xiàn)性好固定相表面化學(xué)能低 .平衡容易 .梯度洗脫固定相選擇多固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好52缺點：流動相PH范圍要控制（PH28） PH太低：Si-C鍵易斷裂 PH太高：硅膠基質(zhì)易溶解游離的硅羥殘基影響分離 53色譜選擇性解析熟練應(yīng)用HPLC技術(shù)仔細(xì)研究和解析大量色譜圖找出固定相溶質(zhì)移動相三者間相關(guān)規(guī)律。通過解析，可以得到：未知化合物極性大小溶解度參數(shù) 空間位置阻礙等方面知識1.色譜分離選擇性的物理概念色譜系統(tǒng)的物理化學(xué)參數(shù)固定相的表面化學(xué)性質(zhì) 流動相性質(zhì)和濃度溫度54 分子

17、間作用力有三種： 定向作用力（取向力） 極化作用力（誘導(dǎo)力） 分散作用力（色散力）影響氫鍵大小因素：隨與H相結(jié)合的原子電負(fù)性的降低而降低只有電負(fù)性較強的原子才可與X-H形成氫鍵氫鍵形成難易與空間位阻有關(guān)55第四章 離子交換色譜、離子對色譜41 離子交換色譜一、原理： 以離子交換劑為固定相，與流動相中離子 型物質(zhì)發(fā)生可逆的離子交換，根據(jù)溶質(zhì)離 子、離子交換固定相、流動相離子之間相 互作用力的差異而導(dǎo)致色譜分離。56二、離子交換劑常見：硅膠為基體的鍵合相離子交換劑PH對交換容量的影響：強酸、強堿性離子交換劑，交換性能不受PH影響，交換容量恒定。弱酸性陽離子交換劑，在較高PH條件下 弱堿性陰離子交換

18、劑，在較低PH條件下 發(fā)生離子交換57三、離子交換色譜的影響因素流動相PH的影響流動相中反離子的形式和濃度 三者相互作用力關(guān)系：.溶質(zhì)對B+的親合力交換能力tR.流動相離子對B+親合力洗脫能力 tR有機溶劑影響5842 離子對色譜離子抑制法通過控制PH，可以控制離子濃度，從而實現(xiàn)在反相柱上對弱酸、弱堿的保留，達(dá)到分離目的。一、原理 色譜過程中，溶質(zhì)離子X和帶相反電荷 的配對離子Y-（固、液相中）相結(jié)合形 成離子對化合物X+Y-，然后在兩相中分 配。59二、正相離子對色譜 常見：固定相：吸附在硅膠擔(dān)體上的水 （含配對離子） 流動相：有機溶劑三、反相離子對色譜常見：固定相：化學(xué)鍵合相 流動相：緩沖

19、溶液（含配對離子） 有機改善劑離子對試劑選擇：酸性物質(zhì)陽離子配對離子（四丁基胺等）堿性物質(zhì)陰離子配對離子（烷基磺酸鹽）60三、反相離子對色譜的應(yīng)用1.分析無機離子a.無機陰離子 b.金屬離子絡(luò)合物2.在生物醫(yī)學(xué)分析中應(yīng)用a.分析測定核苷酸、核苷、堿基b.分析測定維生素c.分析測定生物堿61四、影響離子對色譜分離選擇性因素1.溶劑極性的影響正相：極性洗脫強度 k反相：極性有機溶劑比例洗脫強度 k 2.離子強度的影響反相:水溶液中離子強度 洗脫能力 k3.PH值的影響弱酸：PH值接近7組分完全電離最易形成離子 對k最大 PHX-HX 固定相中離子對減少 k 一般：PH=27.4 PH8 硅膠溶解

20、624.離子對試劑性質(zhì)和濃度的影響正相:離子對試劑烷基鏈?zhǔn)杷跃?合物k反相：離子對試劑烷基鏈?zhǔn)杷?締合物k無機鹽離子對試劑疏水性減少締合物k離子對試劑濃度：10-410-2mol/L5.溫度的影響機械涂敷型固定相：不采用梯度洗脫，恒溫反相離子對色譜：流動相粘度大, 溫度柱效63第五章、體積排阻色譜51 分離機理固定相一定孔徑大小范圍的多孔填料小分子完全進(jìn)入填料小孔中 （完全滲透）大分子完全不能進(jìn)入填料小孔中 （完全排除）中間尺寸分子部分進(jìn)入填料小孔中 （選擇性滲透）64排阻色譜特點：a.樣品峰全部在溶劑的保留時間前洗脫b.柱內(nèi)的峰擴展較小c.峰較窄，有利于檢測d.采用示差檢測器不足：a.峰

21、容量小 b.不能分離大小相似、分子量接近的 組分6552 柱填料、移動相 柱填料要求：a.含大小一定孔徑的多孔填料b.多孔表面不應(yīng)有吸附作用，只存在排除機理分類：1.有機凝膠（交聯(lián)的聚苯乙烯） 半剛性填料，孔徑范圍較寬，分離范 圍較大。非極性有機溶劑，脂溶性樣品 2.無機凝膠（多孔硅膠） 柱效高、分離度好。柱壓低，更換溶劑 時，平衡較快。但易拖尾。66凝膠的選擇滲透極限可以分離的最高分子量 （與孔徑有關(guān)，孔徑大，滲透 極限大）分離范圍校正曲線的線性部分 67移動相選擇a.能溶解樣品b.不應(yīng)造成填料太大的溶脹或收縮c.控制PH和離子強度，可消除非排除機理的影響（離子強度0.050.1 常用磷酸鹽

22、或硫酸鹽 PH接近中性為宜）d.盡量降低溶劑粘度（加電介質(zhì)）e.選擇與樣品折射率差別大的溶劑，提高靈敏度樣品濃度：0.010.5%常用：甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氫呋 喃、水溶液68HPLC 分離類型的選擇根據(jù)試樣的化學(xué)物理性質(zhì)進(jìn)行選擇應(yīng)掌握各分離類型特點、機理、選擇方法每一種分離形式中都可能參與另一種分離形式，僅僅主次之分不同主要根據(jù)試樣的分子量大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶 解度參數(shù)等化學(xué)物理性質(zhì)來確定69a.已知結(jié)構(gòu)試樣查閱文獻(xiàn)資料以其他色譜分離技術(shù)作參考b.分子量較大（M2000）蛋白質(zhì)、高聚物體積排阻色譜c.分子量較?。?M2000）試樣多種溶劑中溶解度情況決定分離類型、填

23、料、流動相由于試樣組分的復(fù)雜性，還需對試樣的來源、性質(zhì)等作詳細(xì)了解，以作選擇參考。70第六章、實驗技術(shù)和輔助實驗技術(shù)61 定性和定量分析一、定性分析利用保留值定性a.與標(biāo)準(zhǔn)物對照 b.將標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品中c.二極管陣列檢測器聯(lián)機定性收集洗脫液后定性分析 71二、定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線法（外標(biāo)法）歸一化法（所有組分都出峰）內(nèi)標(biāo)法（選取內(nèi)標(biāo)物）標(biāo)準(zhǔn)加入法（加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用加入 前后峰面積變化計算）72三、影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度因素樣品制備a. 樣品溶劑與洗脫液互溶性好b. 將干擾組分盡可能分離c.含量低時必須富集回收率試驗：標(biāo)準(zhǔn)物加入已知含量被測樣 品中用制備樣品同樣方法處理定量 測定，得回收率。回收率

24、（測定值樣品值）/加入量73 儲存條件：低溫、干燥、避光 樣品制備包括：a.溶解（超聲波、離心） b.濃縮 c. 萃取 d.預(yù)分離 e.衍生化進(jìn)樣技術(shù)影響因素：a.進(jìn)樣裝置的準(zhǔn)確度和精度 b.分析人員對進(jìn)樣技術(shù)的熟練程度進(jìn)樣六通進(jìn)樣閥（定量進(jìn)樣管34倍）定量方法選擇a.Rs1.5，柱效變化時，采用峰面積定量。b.流速變化時，外標(biāo)法不適用（峰面積影響大）74定量分析不宜采用梯度洗脫（基線易漂移）檢測器特性穩(wěn)定性和線性范圍直接影響定量準(zhǔn)確性a.被測組分濃度和響應(yīng)值呈線性關(guān)系b.進(jìn)樣量不能超出線性范圍7562 HPLC實驗技術(shù)一、色譜柱的保養(yǎng)新柱要作凈化處理平時使用：a.正式進(jìn)樣前，先用流動相沖平衡

25、b.一種流動相換另一種時，需互溶柱的儲存：儲存于相對惰性溶劑中（反相柱用甲醇）對復(fù)雜樣品或易污染樣品，應(yīng)裝預(yù)柱實驗結(jié)束，當(dāng)洗脫液用緩沖液時，水沖洗甲醇保護(hù)76二、流動相的處理流動相的脫氣原因：a.高柱壓下流動相中空氣，會在柱 的洗脫 液流中形成氣泡，干擾檢測器信號。 b.除去氧（氧易與固、流反應(yīng)，不利于柱 穩(wěn)定）脫氣方法：a.真空脫氣法 b.惰性氣體吹脫法 c.超聲波脫氣法77流動相的純化a.將溶劑通過干燥的多孔硅膠漏斗（0.45)b.在進(jìn)樣器之前設(shè)置預(yù)柱，將雜質(zhì)吸附掉流動相配制a.先配制再脫氣，或先脫氣再配制b.對含量少的溶劑必須用移液管精確量取c.如用緩沖液，濃度應(yīng)盡量低些 （0.001mol/L）78三、樣品的預(yù)處理目的：除去微粒 減少