三 DNA的復(fù)制課件

1、3 DNA復(fù)制3.1 DNA復(fù)制的基本原則3.2 DNA復(fù)制的方式3.3 DNA復(fù)制的酶類體系3.4 DNA復(fù)制過(guò)程3.5 端粒和端粒酶3.1 DNA復(fù)制的基本原則 3.1.1 DNA的半保留復(fù)制 概念：在復(fù)制時(shí)，以DNA每條鏈為模板，合成互補(bǔ)鏈，形成的兩個(gè)子代DNA分子與親代DNA分子完全相同，各有一條鏈來(lái)自親本，一條鏈為新合成的。 DNA復(fù)制模式的提出：半保留復(fù)制模式、全保留復(fù)制模式和分散復(fù)制模式 1958年，Meselson及Stahl以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，借助放射性同位素（15N）標(biāo)記和CsCl密度梯度離心（Density gradient centrifugation）等技術(shù)首次證明

2、了DNA的半保留復(fù)制模型的正確性 3.1.2 DNA復(fù)制的半不連續(xù)性 1968年，日本學(xué)者岡崎等用3H-脫氧胸苷標(biāo)記的噬菌體T4感染大腸桿菌，再通過(guò)CsCl密度梯度離心分離出標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)先合成的是1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。說(shuō)明DNA復(fù)制中先合成較短片段，再由連接酶連成大分子DNA DNA復(fù)制是以半不連續(xù)方式進(jìn)行，一條鏈的合成按53方向連續(xù)合成，其合成方向與復(fù)制叉的移動(dòng)方向一致，稱為前導(dǎo)鏈（Leading strand），另一條鏈的DNA合成是在復(fù)制叉打開(kāi)到一定程度后才開(kāi)始的，先合成許多不連續(xù)的小片段（岡崎片段，Okazaki fragment ），最后合成一條完整的DNA鏈，稱為后

3、滯鏈（Lagging strand）。 3.1.3 DNA復(fù)制的引物DNA的合成需要引物，RNA的合成不需要引物。 實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)自M13噬菌體DNA在大腸桿菌細(xì)胞中的復(fù)制過(guò)程被利福平（Rifampicin）抑制的實(shí)驗(yàn)。 目的：保持DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性。原因：DNA聚合酶具有校正活性，而RNA聚合酶沒(méi)有校正功能。在低保真引物完成功能后將其刪除，而代之以DNA聚合酶指導(dǎo)合成的高保真DNA鏈。結(jié)果：使DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性提高了105倍。 3.1.4 DNA的雙向復(fù)制大多數(shù)真核和原核生物的DNA都進(jìn)行雙向復(fù)制，即復(fù)制時(shí)兩個(gè)復(fù)制叉從復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，同時(shí)向兩個(gè)方向推進(jìn)。當(dāng)然也存在單向復(fù)制，即僅有一個(gè)復(fù)制叉運(yùn)動(dòng)

4、，而另一個(gè)復(fù)制叉一直停留在復(fù)制的起點(diǎn)。 Gyurasits和Wake通過(guò)對(duì)枯草桿菌DNA復(fù)制的放射自顯影實(shí)驗(yàn)揭示了DNA的雙向復(fù)制機(jī)制 3.2 DNA復(fù)制的方式DNA中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱為復(fù)制子（Replicon）。原核基因組中只含有一個(gè)環(huán)狀的復(fù)制子，在唯一起始點(diǎn)啟動(dòng)會(huì)引發(fā)整個(gè)基因組的復(fù)制。大腸桿菌基因組從唯一的起始點(diǎn)OriC開(kāi)始進(jìn)行雙向復(fù)制，形成的兩個(gè)復(fù)制叉基本以相同速度推進(jìn)，其復(fù)制終點(diǎn)在OriC正對(duì)面近乎180處。真核細(xì)胞中的每條染色體的復(fù)制均是通過(guò)多個(gè)復(fù)制子完成的，通常也是進(jìn)行雙向復(fù)制，相鄰復(fù)制叉相遇后發(fā)生融合，因此不存在明顯的終止位點(diǎn)。 3.2.1 型復(fù)制 原核生物DNA從起始點(diǎn)開(kāi)始

5、復(fù)制，隨著復(fù)制叉向前推進(jìn)，復(fù)制區(qū)域就像在非復(fù)制區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生氣泡并不斷擴(kuò)大，形成結(jié)構(gòu)。 Cairns揭示了大腸桿菌DNA的型復(fù)制過(guò)程。 3.2.2 滾環(huán)復(fù)制有些環(huán)狀DNA以滾環(huán)模式復(fù)制，即雙鏈中的一條鏈產(chǎn)生一個(gè)缺口，DNA聚合酶從缺口上的3端開(kāi)始，以另一條完整鏈為模板進(jìn)行鏈的延伸，這樣新合成的鏈將替代原來(lái)的親本鏈，好象模板環(huán)在不斷滾動(dòng)。（圖3-7A ） 圖3-7B：噬菌體174的單鏈DNA首先形成雙鏈的復(fù)制型（Replicative form），在DNA正鏈的復(fù)制起始點(diǎn)上進(jìn)行單鏈切斷，5端與A蛋白相連，DNA聚合酶以未切斷的負(fù)鏈為模板，從正鏈的3端開(kāi)始不斷延伸進(jìn)行復(fù)制，5端卻不斷地脫離環(huán)狀模板被剝

6、離出來(lái)，成為越來(lái)越長(zhǎng)的游離單鏈。當(dāng)復(fù)制回到起始點(diǎn)時(shí)，具有內(nèi)切酶活性的A蛋白切割起始點(diǎn)并結(jié)合于新的5端，被替代的正鏈以環(huán)狀形式釋放。 3.2.3 D環(huán)復(fù)制線粒體和葉綠體的雙鏈環(huán)狀DNA從特殊位點(diǎn)開(kāi)始解鏈，但兩條親代鏈中只有一條作為模板（H鏈）合成新鏈，開(kāi)始復(fù)制出一小段DNA，取代了原來(lái)的互補(bǔ)鏈（L鏈），這樣一條單鏈和一條雙鏈組成的結(jié)構(gòu)，稱為置換環(huán)（Displacement loop）或D環(huán)。隨著復(fù)制的繼續(xù)進(jìn)行，D環(huán)不斷擴(kuò)大，L鏈被不斷置換，直至L鏈上的起始位點(diǎn)暴露，開(kāi)始新的H鏈的合成。因此雙鏈DNA的兩條鏈分別有自己不同的Ori。 3.3 DNA復(fù)制的酶類體系 3.3.1 原核生物DNA復(fù)制的酶

7、及蛋白質(zhì)3.3.1.1 DNA聚合酶（DNA polymerases） 大腸桿菌中至少具有5種DNA聚合酶，其中DNA聚合酶是復(fù)制過(guò)程中最重要的酶，DNA聚合酶在復(fù)制、重組以及其他修復(fù)過(guò)程中起清除作用。而DNA聚合酶、則均與DNA的損傷修復(fù)有關(guān)。 表3-1 大腸桿菌DNA聚合酶的比較DNA聚合酶主要作用是在DNA復(fù)制的過(guò)程中負(fù)責(zé)清除RNA引物，該功能依賴于其5 3外切酶活性。 DNA聚合酶的“缺口平移”過(guò)程可用于制備放射性標(biāo)記核酸探針。DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段稱為Klenow片段，失去了原來(lái)的53外切酶活性。 DNA聚合酶至少包含10個(gè)亞基。、三個(gè)亞基構(gòu)成的催化核心，亞基

8、具有53聚合酶活性，亞基具有35外切酶活性，亞基負(fù)責(zé)激活外切酶活性。兩個(gè)亞基形成“夾鉗”（Clamp），套在DNA模板上，在復(fù)制時(shí)沿著模板滑動(dòng)，防止聚合酶從DNA上脫離。二聚化亞基使兩個(gè)催化核心連接在一起。由2組成的復(fù)合體作為夾鉗裝載機(jī)（Clamp loader），負(fù)責(zé)將亞基結(jié)合到DNA上。因此，DNA聚合酶是一個(gè)不對(duì)稱的二聚體，每個(gè)單體都具有一個(gè)催化核心、一個(gè)二聚化亞基、一個(gè)具有前進(jìn)能力的亞基，能同時(shí)催化兩條DNA鏈的合成3.3.1.2 解旋酶（Helicase） 解旋酶能利用水解ATP產(chǎn)生的能量使DNA解鏈。 在大腸桿菌中，有12種不同的解旋酶。 解旋酶通常是多聚體，典型的是六聚體結(jié)構(gòu)。3

9、.3.1.3 單鏈結(jié)合蛋白 （Single-strand binding protein, SSB）單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合并保護(hù)DNA單鏈，阻止其恢復(fù)成雙鏈體狀態(tài)。SSB一般以單體形式結(jié)合，但結(jié)合具有協(xié)同性。大腸桿菌的SSB是一個(gè)四聚體。3.3.1.4 DNA連接酶（DNA ligase）大腸桿菌的DNA連接酶分子量為 74000，能催化雙鏈DNA中單鏈切口處的5-磷酸和3-羥基形成磷酸二酯鍵。連接反應(yīng)需要能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶是以NAD+作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體則是以ATP作為能量來(lái)源。3.3.1.4 拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase） DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，受超螺旋

10、結(jié)構(gòu)所限制。拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠調(diào)控DNA分子超螺旋水平，通過(guò)斷裂和再連接DNA鏈，改變DNA連接數(shù)。類型：型拓?fù)洚悩?gòu)酶斷裂一條DNA鏈，連接數(shù)每次改變1，反應(yīng)無(wú)需供給能量；型拓?fù)洚悩?gòu)酶則斷裂兩條DNA鏈，連接數(shù)每次改變2，反應(yīng)需要由ATP提供能量。3.3.2 真核生物DNA復(fù)制的酶及蛋白質(zhì) 真核細(xì)胞擁有多種DNA聚合酶，在復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中起主要作用的有DNA聚合酶、。 復(fù)制作用的酶一般是多亞基的，而負(fù)責(zé)修復(fù)的酶則通常只有一個(gè)亞基。其中DNA聚合酶復(fù)制線粒體DNA，DNA聚合酶則是一種高保真的堿基切除修復(fù)酶 。 細(xì)胞核DNA的復(fù)制主要涉及DNA聚合酶、和。 DNA聚合酶具有引物酶的活性和聚合酶活性，

11、但不具備校正活性，因此現(xiàn)在認(rèn)為DNA聚合酶起始前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，之后由DNA聚合酶繼續(xù)鏈的延伸工作。DNA聚合酶不僅是具有校正活性的高保真聚合酶，而且具有高度的前進(jìn)能力。 DNA聚合酶有時(shí)能取代DNA聚合酶延伸后滯鏈，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶具有別的活性，比如它也能去除岡崎片段上的引物。表3-2 真核生物主要DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)及功能 3.4 DNA復(fù)制過(guò)程 3.4.1 原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程3.4.1.1 起始 大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)為ori C，由245 bp組成，關(guān)鍵序列：3個(gè)13bp重復(fù)序列（堿基組成：GATCTNTTNTTTT）和4個(gè)9bp重復(fù)序列（堿基組成：TTATNCANA）。 4

12、個(gè)9bp重復(fù)序列為DnaA蛋白提供起始結(jié)合位點(diǎn)，大約24個(gè)DnaA蛋白各帶1個(gè)ATP結(jié)合在此位點(diǎn)上，并聚集在一起形成核心，DNA纏繞其上。HU蛋白與DNA結(jié)合，促使雙鏈DNA彎曲，使DnaA蛋白作用于鄰近3個(gè)成串排列的、富含AT的13bp序列。在ATP存在的條件下，3個(gè)13bp序列被變性，成為首先解鏈的位點(diǎn)。緊接著，2個(gè)DnaB-DnaC復(fù)合體進(jìn)一步結(jié)合到解鏈區(qū)上并取代DnaA對(duì)13bp序列的結(jié)合，復(fù)合體分別結(jié)合于解鏈區(qū)的兩端，各自包含1個(gè)DnaB六聚體和6個(gè)DnaC單體。DnaB利用其解旋酶活性繼續(xù)擴(kuò)大解鏈區(qū)，每個(gè)DnaB進(jìn)一步激活一個(gè)DnaG引發(fā)酶，在兩個(gè)復(fù)制叉上分別開(kāi)始進(jìn)行前導(dǎo)鏈和后滯鏈

13、上RNA引物的合成，并開(kāi)始DNA的復(fù)制在細(xì)菌的ori C中，共有11個(gè)GATC序列，Dam甲基化酶能使其中的腺嘌呤N6被甲基化。當(dāng)DNA完成復(fù)制后，ori C是半甲基化狀態(tài)。半甲基化的起點(diǎn)不能發(fā)生復(fù)制的起始，直到新鏈的ori C被完全甲基化。起點(diǎn)處的GATC的半甲基化持續(xù)時(shí)間（13min）大大超過(guò)基因組其余部位的GATC的半甲基化持續(xù)時(shí)間（1.5min）。只有與ori C靠近的dna A基因啟動(dòng)子的再甲基化需要相同的延遲期。當(dāng)dna A啟動(dòng)子處于半甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄被阻遏，Dna A蛋白濃度降低。即當(dāng)關(guān)鍵性起始蛋白Dna A的合成受到阻遏時(shí)，起點(diǎn)也是無(wú)活性。 3.4.1.2 延伸延伸階段同時(shí)進(jìn)行前

14、導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，前者持續(xù)合成，后者分段合成 前導(dǎo)鏈開(kāi)始合成后就一直繼續(xù)下去，保持與復(fù)制叉處DNA的解旋同步。后滯鏈的合成則是分段進(jìn)行的，需要不斷合成岡崎片段的RNA引物，然后由DNA聚合酶延長(zhǎng)。由于DNA的兩條互補(bǔ)鏈方向相反，又由同一個(gè)聚合酶的不對(duì)稱二聚體所催化，即二者的合成應(yīng)該是協(xié)調(diào)一致的。因此，后滯鏈必須繞成一個(gè)突環(huán)（Loop） DnaB具有激活引物酶DnaG的功能，二者組合形成引發(fā)體（Primosome）。引發(fā)體由ATP提供能量沿復(fù)制叉方向運(yùn)動(dòng)，DNA聚合酶的一個(gè)催化核心連續(xù)合成前導(dǎo)鏈，同時(shí)另一個(gè)催化核心在后滯鏈突環(huán)上從一個(gè)岡崎片段滑動(dòng)到另一個(gè)岡崎片段，無(wú)需從聚合酶復(fù)合體上解離下來(lái)。

15、其基本過(guò)程如下：在DnaB解旋時(shí)，與之結(jié)合的DnaG合成一小段岡崎片段的引物，合成的方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反。一個(gè)新的夾鉗在此處被裝配，使DNA聚合酶的一個(gè)催化核心被定位在該引物上。接著，DNA聚合酶在引物3-OH端延伸片段，直到遇到上一個(gè)岡崎片段的引物為止，可能正是此停頓成為合成下一個(gè)岡崎片段RNA引物的信號(hào)，開(kāi)始又一個(gè)岡崎片段的起始合成。隨即夾鉗解離，釋放催化核心和DNA鏈。催化核心再與下一個(gè)起始位置上的夾鉗連接，開(kāi)始下一個(gè)岡崎片段的合成 3.4.1.3 終止細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉一般以近似相同的速度一起向前推移，最后在oriC的對(duì)面相遇，此為復(fù)制的終止區(qū)域（Terminus regi

16、on）。大腸桿菌有5個(gè)終止位點(diǎn)，分別以terAterE表示，每個(gè)ter的終止作用都是不對(duì)稱的，即不讓對(duì)側(cè)的復(fù)制叉超過(guò)中點(diǎn)后繼續(xù)復(fù)制。ter位點(diǎn)上的23bp保守序列是Tus（Terminus utilization substance，終止利用物質(zhì)）蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。Tus-ter復(fù)合體能阻礙DnaB的解旋酶活性，使復(fù)制叉的移動(dòng)停止，有效避免復(fù)制過(guò)量情況的發(fā)生。兩個(gè)復(fù)制叉匯合之后，復(fù)制停止。此時(shí)兩環(huán)狀染色體相互纏繞，成為連鎖體（Catenane）。連鎖體的分離需要拓?fù)洚悩?gòu)酶參與作用，從而使兩個(gè)連鎖體的閉環(huán)雙鏈DNA彼此解開(kāi)，在細(xì)胞分裂時(shí)分別進(jìn)入子細(xì)胞 3.4.2 真核生物DNA復(fù)制的要點(diǎn)3.4.2

17、.1 起始真核染色體具有多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子都擁有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)釀酒酵母的自主復(fù)制序列（Autonomously replication sequence，ARS）可能相當(dāng)于復(fù)制的真正起點(diǎn)。 ARS以不同的概率被使用 不同ARS元件均具有11bp的保守序列，富含AT堿基對(duì)，其臨近序列也富含AT，但不具有保守性。 所有真核生物DNA復(fù)制的起始都需要蛋白質(zhì)ORC（Origin recognition complex），ORC相對(duì)分子質(zhì)量約400103，由6種蛋白質(zhì)組成。在整個(gè)復(fù)制過(guò)程中，ORC與ARS的11bp共同序列及臨近序列結(jié)合，說(shuō)明復(fù)制的啟動(dòng)可能依賴其條件變化，而不是重新與起始點(diǎn)的結(jié)合。

18、 執(zhí)照因子（Licensing factor）MCM2 MCM7的存在則是復(fù)制起始所必須的。在復(fù)制前與染色體物質(zhì)結(jié)合，但在復(fù)制后可能被快速降解，只有在下次細(xì)胞分裂后才能重新進(jìn)入細(xì)胞核 真核生物DNA復(fù)制的模型：解旋酶在某一特定復(fù)制原點(diǎn)上使雙螺旋解螺旋，具有啟動(dòng)功能的DNA聚合酶在2個(gè)復(fù)制叉上合成約10個(gè)核苷酸的RNA引物和隨后約2030個(gè)核苷酸的DNA，之后，酶被其他DNA聚合酶取代而進(jìn)行延伸反應(yīng)，這就是所謂的“聚合酶開(kāi)關(guān)”（Polymerase switch）。在DNA復(fù)制延伸的過(guò)程中，三種聚合酶分別行使功能，前導(dǎo)鏈由具有高度前進(jìn)性能力的DNA聚合酶繼續(xù)復(fù)制，此時(shí)DNA聚合酶繼續(xù)在后滯鏈上合成引物和一小段DNA岡崎片段，然后這段岡崎片段由第三種DNA聚合酶（或）完成合成。各種輔