細胞因子以及抗體檢測技術(shù)

1、關(guān)于細胞因子及抗體檢測技術(shù)第一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月背景知識研究細胞因子對闡明機體免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)機制、免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和指導(dǎo)臨床治療均具有重要意義抗體具有高特異性、高親和力等特點，目前已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等各個領(lǐng)域第二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 細胞因子的檢測方法： 1) 生物學(xué)方法 依賴性細胞株 ：生物分析法 功能檢測 ：生物分析法 2) 分子生物學(xué)方法 分子雜交技術(shù) ：mRNA表達水平的測定 多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的測定 3）免疫學(xué)方法 免疫測定 ：免疫酶技術(shù) 功能測定與抗體抑制 第三張，

2、PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體檢測技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)間接血凝試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定 第四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶聯(lián)免疫吸附測定實驗 (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay 第五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 基于NP30抗獨特型抗體可替代蟲源性抗原率先應(yīng)用生物技術(shù)制備抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)蟲源抗原血吸蟲抗體屬短程抗體，治療后陰轉(zhuǎn)較快，具有療效考核價值 該試劑盒的診斷效能多項指標(biāo)均已達到或超過經(jīng)典抗體檢測法，較以前病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測方法，更為簡便快速優(yōu)點：僅用一滴血，20分鐘即可判讀

3、結(jié)果，不需其他儀器設(shè)備，便于在基層、現(xiàn)場使用本試劑盒已在血吸蟲流行區(qū)已應(yīng)用近120萬人次 第六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月管曉虹（1946-2012），女，漢族，江蘇丹陽人，博士，教授，博士生導(dǎo)師。農(nóng)工民主黨員。農(nóng)工民主黨第十二、十三屆中央常委，第九、十屆全國人大代表，江蘇省婦聯(lián)副主席。1970年畢業(yè)于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；1981和1985年先后在原南京醫(yī)學(xué)院獲醫(yī)學(xué)碩士和醫(yī)學(xué)博士學(xué)位；1988年在美國布朗大學(xué)作博士后研究。曾任寄生蟲學(xué)教研室副主任、江蘇省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室主任、衛(wèi)生部抗體技術(shù)重點實驗室主任。承擔(dān)國家“七五”、“八五”、“九五”科技攻關(guān)項目各1項（血吸蟲病免疫診

4、斷）；國家“863”計劃項目1項和國家自然科學(xué)基金項目6項；發(fā)表論文100余篇；主編或參編衛(wèi)生部規(guī)劃教材6部；獲部省級科技進步二等獎2項、三等獎2項；獲國家發(fā)明專利授權(quán)6項。獲“全國優(yōu)秀教師”、“國家級有突出貢獻的中青年專家”等榮譽稱號。享受國務(wù)院政府特殊津貼。第七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗原理是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫技術(shù)此項技術(shù)自70年代初問世以來,發(fā)展十分迅速優(yōu)點：微量、特異、高效、經(jīng)濟、方便、安全等廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域第八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗原理 ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性

5、檢測抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進行定性或定量分析第九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月方法類型 ELISA既可測抗原又可測抗體，根據(jù)試劑來源、標(biāo)本性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計出不同類型的檢測方法： 1.直接法 2.間接法 3.雙抗體夾心法 4.雙夾心間接法第十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、試劑

6、及儀器準(zhǔn)備（一） 免疫吸附劑1.固相載體 要求： 吸附力強 能保持Ag或Ab活性 不參與化學(xué)反應(yīng) 第十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 載體性能比較 要求：載體材料+、- 結(jié)果差別大 檢測方法：10ug/L IgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV10% 常用載體： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板第十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2. Ag或Ab：純度高、效價高、結(jié)合力高3. 免疫吸附劑(固相Ag或Ab)： 包被：將Ag或Ab固相化的過程包被緩沖液、包被方法 封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非

7、特異吸附的干擾第十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶結(jié)合物：1. 要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定2. 常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3. 底物：HRP可溶性底物及呈色： 鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍色(450nm) 5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm) 魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色： DAB：棕黃色 -萘酚：紅色 3-氧基-9-乙基卡唑：紅色 4-氯-1-萘酚：灰藍色AP可溶性底物及呈色： 對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm) 4-甲基傘基磷酸酯(4-Mu

8、P)：熒光AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色 -半乳糖苷酶： 4-甲基傘基-半乳糖苷：熒光第十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 酶結(jié)合物的制備： 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法第十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀 指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計 性能指標(biāo)：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性 優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達0.5%操作：室溫宜在15-30，使用前先預(yù)熱儀器15-30

9、min，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀第十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、操作步驟（間接ELISA法）樣本的收集包被抗原封閉加稀釋的待檢樣品加酶標(biāo)抗抗體加底物顯色終止反應(yīng)第二十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）樣品的收集和保存： 1. 溶血標(biāo)本可增加非特異性顯色(Hb作用 于HRP的輔基)； 2. 細菌污染標(biāo)本因菌體內(nèi)源性酶而假“-” (破壞Ag或Ab)或假“+”(非特異蛋白)； 3. 反復(fù)凍融可使抗體效價下降而假“-”； 4. 陳舊標(biāo)本可使I

10、gG聚集，引起間接法本 底增加； 5. 標(biāo)本中含NaN3，可出現(xiàn)假“-”。第二十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）包被 包被(coating)：將抗原或抗體固定在固相載體的過程 原理：物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用；這種物理吸附是非特異性的 影響因素：受蛋白質(zhì)分子量、等電點、濃度等 大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面第二十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月包被條件 pH9.6 碳酸鹽緩沖液 pH7.2 磷酸鹽緩沖液 pH7-8 Tris-HCl緩沖液。 方法：加入包被液后，在4-

11、8冰箱中放置過夜或37中保溫2小時。 濃度：隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。 一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml第二十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 最適工作濃度的選擇 可用棋盤滴定法在夾心ELISA法中選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度，即利用棋盤滴定，將包被抗體和酶標(biāo)抗體稀釋成一系列濃度，反應(yīng)后顯色。陽性值在0.8左右，陰性值小于0.1為最適，可據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度第二十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度 用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50l:8

12、00)后，按行進行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標(biāo)抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強陽性參考血清A值；為08左右，陰性參考血清A值01的包被抗原稀釋度為工作濃度第二十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）封閉封閉(blocking)：是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，可以高濃度

13、使用（5%）。第二十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）加樣（抗原或抗體）純化抗原/抗體：天然但干擾多合成抗原/抗體：多肽分子較小，常有空間位阻基因抗原：與片段的選擇和制備水平有關(guān)第二十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月對照設(shè)定陽性對照品(positive control)陰性對照品(negative control)目的: 是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。要求：陽性對照品：基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量陰性對照品：須先

14、行檢測確定不含待測物質(zhì)第二十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）加酶標(biāo)抗體 酶標(biāo)記的抗體（原）：ELISA中關(guān)鍵的試劑要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等第二十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（六）顯色顯色：酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。影響因素：溫度、時間 在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進

15、行。TMB：受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。第三十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（七）結(jié)果判定 操作方法：拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。 結(jié)果判定：光密度（oplical densit

16、y，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。第三十一張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月定性測定 定性測定的結(jié)果判斷作出“有”或“無”的回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義 在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色

17、深于陽性孔第三十二張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 定量測定 ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區(qū)域。第三十三張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、基本操作注意事項（一）加樣:一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。方法：加

18、樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。第三十五張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）孵育 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實驗室中常用的孵育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。第三十六張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）洗滌 洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著實驗的成敗。洗滌目的：達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。 可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。第三十七張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十九張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四、實驗中常出現(xiàn)的問題1. ELISA出現(xiàn)“一片黃”的原因： 酶結(jié)合物濃度過高 底物不新鮮 洗滌不干凈2.ELISA出現(xiàn)“一片白”的原因： 載體吸附性能差 底物錯 稀釋液作包被液 加錯試劑 包被時間過短 酶活力低或下降 樣品含有NaN3第四十張，PPT共四十四頁，創(chuàng)作于2022年6月間接ELISA法操作步驟1.樣本的