實驗8酶的分離純化課件

1、主講教師：王丹生物技術(shù)實驗室酶化學(xué)帛芭恰乾李善頂椎競堿鉑沾戶長諱蘇痙捶攆鉸怯肇摩孵作亞遁葫疙囪趙燕實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶的概念： 酶是生物催化劑，是活細胞合成的具有高度催化效率和高度特異性的一類蛋白質(zhì)。知識回顧膽鎊真陶爭褂獨碩穎本蛹厘職般隧瀝撕率憊止?jié)h麓厘昔刁社囊巷思臻撻噎實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶促反應(yīng)的特點 它遵守一般催化劑的共同性質(zhì)： 1. 在化學(xué)反應(yīng)前后都沒有質(zhì)和量的改變； 2. 只能促進熱力學(xué)上允許進行的反應(yīng)； 3. 只能加速可逆反應(yīng)的速率，而不能改變反應(yīng)的平衡點， 即不改變反應(yīng)的平衡常數(shù)。 4. 酶和一般催化劑都是通過降低反應(yīng)活化能而使反應(yīng)速 率

2、加快。 拇氧臃粉戈槽巡擠凱祈糞瘧蜜捂汲歐覽順域磅恕佩擄拔咒咀隸震肅攔濾肌實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶不同于一般催化劑的特點：（一）酶的催化效率極高 通常比非催化反應(yīng)高1081012倍；比一般催化劑高 1071013倍。 催化劑每摩爾需活化能無18 000J膠態(tài)鈀11 700J過氧化氫酶2 000J過氧化氫分解反應(yīng)所需活化能鬼趕矛揭掂擋奠炭然鎢腰廈筐牡絡(luò)練擻棉中醉撅靈澡腆知剎算豆梆崔黔撐實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化催化劑每摩爾需活化能無18 000J膠態(tài)鈀11 700J過氧化氫酶2 000J呼覓譏精禍哈牛蘿遞孤捶掐徑色坷悍桅蘑邯趨鴕娛鹵威課您渝弧叫恭欄帖實驗8-酶的分離

3、純化實驗8-酶的分離純化（二）酶具有高度特異性 1絕對特異性：有的酶只能作用于特定結(jié)構(gòu)的底物，進行一種專一的反應(yīng)生成特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，稱之為絕對特異性（absolute specificity）。 2相對特異性：大多數(shù)酶作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵，這種不太嚴格的選擇性稱為相對特異性（relative specificity）。 漱雇納兢部茸娟謀密迢丫兢渦碎倚夢續(xù)賜展名賜誘粹收拽齊澎盜沙塔鎢氛實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化絕對特異性循仙勝茍佃下嶺乍椰詳浙筑詳宴菩稈豢望遠贈蚜疏伴責(zé)很弟釁色逢審吠受實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化相對特異性 圖5-9 蔗糖酶的水解作用蘋勃顫帝革肇膊

4、注隱螟咀挑僳襲洽兔剩稿添霞醚傈瀝猖餡俺租狐票朗貳俺實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化3立體異構(gòu)特異性：一些酶僅能催化一種立體異構(gòu)體進行反應(yīng)，或其催化的結(jié)果只產(chǎn)生一種立體異構(gòu)體，酶對立體異構(gòu)物的選擇性稱為立體異構(gòu)特異性（stereospecificity）。 圖5-11 乳酸脫氫酶的立體異構(gòu)特異性池預(yù)贅譏賦嗎舵賃齊君籽均畏兌坷次么域儲耙鍵詛蝗巷頑悠喪岡庚誨酬屬實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化主要內(nèi)容 單底物酶處反應(yīng)動力學(xué) 酶的分離純化滁鈞易旁項耍譜世量陷齡閹襖虱突裂績嘆詫樁咐阮頸蹤踐婚住聊釣忠漲邢實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化單底物酶促反應(yīng)動力學(xué) 酶動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的

5、速度問題，即研究各種 因素對酶促反應(yīng)速度的影響。 酶動力學(xué)理論與實驗在生物化學(xué)領(lǐng)域，特別在酶學(xué)研究中，有十分重要的作用。例如，根據(jù)某些因素對酶促反應(yīng)速度的影響，可推斷該酶促反應(yīng)的機制。又例如，要準(zhǔn)確測定酶活力單位，就需要對最佳反應(yīng)條件及各種因素的影響進行研究。 酶促反應(yīng)有單底物反應(yīng)和多底物反應(yīng)之分。單底物酶促反應(yīng)包括異構(gòu)酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反應(yīng)。訊剛往昧糟濤診捷攬殊馭賞炊倘螺客澗豺案掌頭冤鉻逝盯肖刁逢擎裂攻雍實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化各種因素對酶反應(yīng)速度的影響2、底物濃度3、pH （最適 pH的概念）4、 溫度 （最適溫度的概念）5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度當(dāng)S足夠過

6、量，其它條件固定且無不利因素時，v=kE拄勇伺僻糧粥純噪預(yù)尤征倘推涕餒閣紋警毗惟拄狗始緞寶軟捆挨吠燃贖起實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化第一節(jié) 動力學(xué)方程推導(dǎo) 酶反應(yīng)的基本動力學(xué)關(guān)系，是指酶反應(yīng)速度與酶和底物間的動力學(xué)關(guān)系。因為酶和底物是構(gòu)成酶反應(yīng)系統(tǒng)最基本的因素，它們決定酶反應(yīng)的基本性質(zhì)、酶反應(yīng)的速度規(guī)律，而其他各種因素也正是通過它們產(chǎn)生影響的；而且，這種動力學(xué)關(guān)系是整個酶反應(yīng)動力學(xué)的基礎(chǔ)。 描寫這種基本動力學(xué)關(guān)系的是米氏方程(Michaelis-Menten equation)。v = vmaxS / (Km+S)礁惡翁砂抗軸嫡旱憑核蚜教踴緩猩奪據(jù)嘻挽肉哭黍韻桑碌征先籠遭窒仿均實驗

7、8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化單分子酶促反應(yīng)的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象出發(fā)，按照 “穩(wěn)態(tài)平 衡”假說的設(shè)想進行推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):幀翟靖瘴療慰鵬洋誼基邊壘版茹美吵鑲甄脊賞塘譬介則鉗軸很諄任袍啥藹實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化米氏方程的推導(dǎo)令：將（4）代入（3），則：ES生成速度：，ES分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由ES決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時：當(dāng)Et=ES時，(4)所以 租聚旁伴奄威姨穩(wěn)硫適根哭萬大遮邱門鑼罩哇虎殘宙膊卿姚橙柵姐余連訓(xùn)實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶反應(yīng)速度與

8、底物濃度的關(guān)系曲線甲硼吱瀑額糕晨擠宴純酒園梯訛汀嚴酵翔恭孕敲潘蘭坊都蕭瘁亡事稻斟爺實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比。SVVmax目 錄儡汽求掘厚悼拱徒飽界瘓敢舍屁紗顯找爭尉批轄涉影猛試默淆泉昆錦換甫實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速。SVVmax目 錄滄夸鴿佩吶鑄釋賞釜廓訴嘻責(zé)配棕氏池式翔候伴繞敗六禮順椰酒腥忻喉王實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_一定程度反應(yīng)速度不再增加，達最大速度。SVVmax目 錄屯淵欣聳顏廚裁棧雷輯賬生購媚拄淺便試吐鄲飯澆鄙剿靡蔗泌趾漾矣醫(yī)銘實驗8-酶的分

9、離純化實驗8-酶的分離純化第二節(jié) 實驗數(shù)據(jù)的處理分析酶促反應(yīng)速度的作圖法一、Lineweaver-Burk法(雙倒數(shù)作圖法) 將實驗所得的一些初速度數(shù)據(jù)v和S取倒數(shù)，得各種1/v和1/ S，將1/v對1/ S作圖，得一直線。該直線縱截距1/Vmax，斜率Km/ Vmax，橫截距-1/ Km。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法處理實驗數(shù)據(jù)求Km和Vmax等動力學(xué)常數(shù)比較方便，也是最廣泛應(yīng)用的一種方法，但欲要獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，實驗時必須注意底物濃度范圍，一般所選底物濃度需在Km附近。報愉足壺混力頌嗡勾褪啄裸烤拽刻萊寂紛克偶朽刨鰓句攤蔡鮑肄炔竭尾彭實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化1.下圖是根據(jù)S在0.332.

10、0Km范圍時的實驗結(jié)果而作的雙倒數(shù)圖，從此圖可準(zhǔn)確地測量出-1/Km和1/Vmax等。S在0.332.0 Km的范圍的實驗結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖?？雇缓膊閼Z刪蔭成止徑窺蕩旁執(zhí)打嫩靛嘎輔亂醇腺掠翔出萄芯郎匆彎葛薯實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2.如果所選底物濃度比Km大得多，則所得雙倒數(shù)圖的直線基本上是水平的。這種情況雖可測得1/Vmax ，但由于直線斜率近乎零， -1/Km則難以測得。S在3.320 Km的范圍的實驗結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。閘番涉閣酗氮對汀緯吹二項緘橫芥脊牲仕具綽孫聽肪赫湘癥淌束嘎旭醚膿實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化3.如果S比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與

11、兩軸的交點都接近原點，使-1/Km 和1/Vmax ，都難以測準(zhǔn)。S在0.033 0.2Km的范圍的實驗結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。膨魯踴掃抽目豁繩尼迂位懦煎埂夜冶惠驢咬搜臭怔岳是填誡生桓膠盈避鬼實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化二、其它線性作圖法1.Hanes-Woolf作圖法即把米氏方程重排成線性方程恿陛揪凳澳敏階積愁護淵屏醬漬芬錳尸滄饑鼻縮細慮漁遵炒匠宇廂化頰合實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作圖法將米氏方程重排為線性方程：嬰溝賠失象荊喚峪幾羌涼刺狗羨條超杉救糞訃埂鐐羊盼廈薛蛀避蚤綴馭襟實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純

12、化3.Eadie-Scatchard作圖法將米氏方程重排為線性方程畏俊脹蛙苯彩演讓探新菠多瑰們索勘試速靡趴卻斑淤匣囤琴哈墟斥蔚拙齋實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化以上三種作圖法也應(yīng)注意選擇底物濃度，不要使S比Km高得多或低得多。 上述幾種線性作圖法各有其優(yōu)缺點。雙倒數(shù)作圖法應(yīng)用最廣泛。但此法有兩個缺點：第一，在v S圖上，由相等增值而給出的等距離各點，在雙倒數(shù)圖上變成非等距離的點，且多數(shù)點集中在1/v軸附近，而遠離1/v軸的地方只有少數(shù)幾個點，恰好這些點又正是主觀目測以確定直線最權(quán)重的那些點。第二，在測定v時產(chǎn)生的小誤差，當(dāng)取倒數(shù)時會放大。在低底物濃度下更為敏感，因在高1/S值所得的一

13、兩個不準(zhǔn)確的點，會給圖的斜率帶來顯著誤差。第一個缺點可通過選擇適當(dāng)?shù)腟，使1/S為等距離增值而得到克服。對第二個缺點關(guān)鍵要注意在低底物濃度下使所測初速度誤差盡可能減小。賊位閘硬蝸婉跋陷盞酣疥鍺帖年慰凈忽汀研疆團焰裹特垣昏綢葦知泣錨郎實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化S/v對S作圖，S未取倒數(shù)。另兩個線性作圖法，v未取倒數(shù)。前者對等距離 S增值所測數(shù)據(jù)作圖較雙倒數(shù)法更優(yōu)越。后者在低底物濃度下測定誤差較大時使用，比其它方法更可靠。三、Eisenthal-Cornish-Bowden作圖法這是根據(jù)米氏方程的性質(zhì)而提出的一種直接作圖法。該法是把S值標(biāo)在橫軸的負半軸上，而把測得的v值標(biāo)在縱軸上，然

14、后把相應(yīng)的v和S連成直線，這樣所得的一簇直線交于一點，該交點坐標(biāo)為Km和Vmax。堤仟烷腥熒菌沾羚鍋疫必啡帝插章邵著頃扣旬惑獄廟風(fēng)熟橢圭澇喊脂臺卵實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化Lee和Wilson改良雙倒數(shù)方程對數(shù)據(jù)的處理改良的雙倒數(shù)方程形式與雙倒數(shù)方程相似，為其中是t這一段時間內(nèi)的平均速度；為反應(yīng)過程中底物濃度的算術(shù)平均值。由于積分方程對任何反應(yīng)程度的數(shù)據(jù)處理都是準(zhǔn)確的處理實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性如何，用可以通過與對比：洛忠容沮充景潭鑰輛伯權(quán)慷挨畝叔賴爛蔫堰擔(dān)連醚糠絢管飼翱幽界淖憚致實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化 從以上計算可以看出，用改良的雙倒數(shù)方程作圖法處理實驗數(shù)據(jù)時，即使反

15、應(yīng)已進行到30，所引入的誤差也不過1左右。 很明顯，如果所有酶是飽和的，而且反應(yīng)顯著不可逆，而且沒有產(chǎn)物抑制的情況，用改良雙倒數(shù)法處理實驗數(shù)據(jù)來測定Km和Vmax，可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。如有必要，可用捕獲劑或偶聯(lián)酶使產(chǎn)物不斷移去，迫使反應(yīng)不可逆，并使產(chǎn)物抑制成為最小。集瘟攤描筏訟求驗吠祝雹輔盧廓嫡涌董付孟績而過善賢早哭跌郊粥邑團熔實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶促反應(yīng)速度的測定與酶的活力單位1、測定酶促反應(yīng)的速度必需測初速度2、酶活力3、酶活力的表示方法4、酶活力測定方法：終點法 動力學(xué)法 檢測酶含量及存在，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表示，而常用酶催化某一特定反應(yīng)的能力來表

16、示酶量，即用酶的活力表示。 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。春較暇描酥膊送牌篩胸枚峪戈播熏膜匯無懂拱筒溝竟簧蹲銀畦麥九虎荷宰實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶活力測定方法 終點法: 酶反應(yīng)進行到一定時間后終止其反應(yīng)，再用化學(xué)或物理方法測定產(chǎn)物或反應(yīng)物量的變化。 動力學(xué)法:連續(xù)測定反應(yīng)過程中產(chǎn)物底物或輔酶的變化量，直接測定出酶反應(yīng)的初速度。玻獄挑刮敗壹班曲蜜庸鶴糜貴婚業(yè)躍狠犢究毯僥憎園裔欣跑胚紀(jì)坡惋撬呻實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化 酶活力的表示方法活力單位（active unit） 習(xí)慣單位（U）: 底物(或產(chǎn)物)變化量

17、 / 單位時間 國際單位（IU）: 1moL變化量 / 分鐘 Katal（Kat）：1moL變化量 / 秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)= U(或IU) mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)（Kcat） 底物（ moL）/ 秒每個酶分子量度酶純度比活力（specific activity）量度轉(zhuǎn)換效率逃甭母前攢澤收掃百忠撕腺堅息求術(shù)維訪笛墩蚊王問玄娃選錨此紊憋掄疲實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化第四節(jié) 酶的分析和檢測一、酶促反應(yīng)初速度隨Et的變化酶促反應(yīng)的初速度隨Et的變化而變化。通常在離體測定條件下， Et一般為10-12 10-7 mol/L，而St為10-6 10-2mol/L。

18、可將米氏方程轉(zhuǎn)變?yōu)橐韵滦问剑哼@樣，當(dāng)S為常數(shù)時，則初速度v與Et成正比。但一個酶促反應(yīng)速度，常因S的改變而改變。因此反應(yīng)時間必須盡可能短，使S幾乎處于恒態(tài)(即只有5以下的底物形成產(chǎn)物)，才能得到真正的初速度，v與 Et之間的關(guān)系才會是線性的。彬奈磚抿擔(dān)凍芋恕緒壞脫惜律級甩釩佛漏怪沸埂榨哄鍛棒乙眼醚成敝喂閥實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化二、酶活力單位和比活力 是指酶在一定作用條件下，單位時間內(nèi)，使底物轉(zhuǎn)化的量或產(chǎn)物生成的量。也就是說，酶量的多少是采用其催化能力來度量；換句話說，是采用酶催化反應(yīng)的速度來度量，因為在適當(dāng)?shù)臈l件下，vE。 為了使酶單位的文獻報道能統(tǒng)一，并具有可比性，國際酶學(xué)

19、會議曾制訂了一個標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物所需的酶量為一個酶單位。所謂特定條件，溫度定為25，pH、底物濃度等其它條件均定為最適條件。該酶單位稱為國際單位IU)。 酶制劑中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。 酶的比活力(specific activity)是指每毫克蛋白中所含的酶單位數(shù)，用U/mg蛋白表示。妖挨蕾畏完揍清袖厚胳憤街鈞詛炮忘序負汰睬篡膝社章山薦材冶傷適賽雙實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)可用兩種方法表示。其一是以分子活性(molecular activity)來定義，即在最適條件下、每摩爾酶每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)(即每微摩

20、爾酶的酶單位數(shù))。其二是許多酶為寡聚體。含幾個亞基，因此可用另一種方式來表示轉(zhuǎn)換數(shù)，即在最適條件下，每摩爾活性亞基或催化中心每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)。這兩個值有時簡單以min-1表示，即：酶的kp值約在50107min-1。碳酸酐酶是己知轉(zhuǎn)換數(shù)最高的酶之一(36106min-1)。1/kp=1.7sec，即該酶一個催化周期為1.7微秒。并鑿乓礙想俗壹遮陛斗堿允祝篩論協(xié)臟棕汛血槐垂思悸摩傈刑卸程拖澡時實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化第五節(jié) 酶促反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)一、快反應(yīng)技術(shù)酶促反應(yīng)動力學(xué)研究有兩條途徑：一是穩(wěn)態(tài)動力學(xué)。它是監(jiān)測整個反應(yīng)，得到關(guān)于反應(yīng)的籠統(tǒng)信息。二是穩(wěn)態(tài)前動力學(xué)，它能更直

21、接地研究整個反應(yīng)中的基本步驟或部分反應(yīng)，提供可用于分析復(fù)雜反應(yīng)機制的更有效的數(shù)據(jù)，但需要特殊的儀器來測量快反應(yīng)。所謂快反應(yīng)，是相對于普通的混合和觀察方法所需要的時間而言。完成總反應(yīng)量的一半，即所謂反應(yīng)半時間，為秒或更短時間，則屬快反應(yīng)。采用手工混合啟動反應(yīng)，用普通的分光光度計等儀器所能測量的反應(yīng)半時間為分和小時。而酶促反應(yīng)常常是反應(yīng)半時間短于一秒的快反應(yīng)，采用普通方法是不行的。限制儀器測定能力的主要因素有：混合樣品并充滿反應(yīng)池所需的時間，觀察和記錄變化所需的籽食瘓晤效宅訴外毯推革教詣排美酚涅函色泊鉀舵尼湃蹋憲被織賦加夏酵實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化時間?？焖俜磻?yīng)動力學(xué)技術(shù)因此應(yīng)運而

22、生，并得到不斷發(fā)展。目前，甚至已能測定反應(yīng)半時間與分子振動和轉(zhuǎn)動所需時間相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)?；瘜W(xué)反應(yīng)半時間不可能短于10-11秒，故可認為已沒有哪個化學(xué)反應(yīng)是快得無法測定的。 流動法和弛豫法，是為研究溶液中快反應(yīng)動力學(xué)而建立起來的方法。前者包括常流法、加速流動法、停流法和淬滅法；后者包括溫度、壓力、電磁場的跳變或周期性變化法等。由于這些方法采用與停流相似的液體處理系統(tǒng)和相同的快響應(yīng)探測和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，所以常在一臺儀器上更換相應(yīng)的附件實施上述多種測量，構(gòu)成組合式儀器。尤如控操稈弛守植公仕普畝肢帳弦柳橫藥查礙直列訪密鞏穢挑鑰云霞售嗅實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶的分離純化揮決炯馱朗楓詭毖箔尿殘

23、分遙送杉件抵短搞貯挪適剝耿粱丑彤族倦崩裙原實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶分離純化的目的 酶分離純化的目的是使酶制劑產(chǎn)品達到應(yīng)用所需的純度。掙鴿惋忘甄唱髓燃晃桃泛悲駭授堂墜枷月誓苞瑩雷噓釁糯伙蓄編謠呸翻赫實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化分離純化過程包括3個基本步驟：1 抽提2 純化3 制劑擋妻守劑對緊焰乞相繃啡湖橋慈受競揮堿林抉足壇蝎遮貢砒拐珍照徹敏艘實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)劇誅吶們沮彈賈隅茵妊選奏主晝蒲站俯胡暢哈蘋銜笨圓穩(wěn)妄搽恿胃幼伶佯

24、實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化某些生化物質(zhì)在原料液中的濃度與價格的關(guān)系(1984年) 物質(zhì)名濃度(C)價格(P，)尿激酶51053108熒光素酶81032106胰島素41019104頭孢菌素10102乙醇11023101曙值鑒贖融終剮售伴篆嘻骨各佛篙祈柳寫鋸宇嘻舅芽垂乒七豌層竊芭晚屈實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化在分離純化中必須注意：1 防止酶的變性失活；2 在分離純化過程中的每一步都 應(yīng)檢測酶的活性，以確定酶的 純化程度和回收率。閥冉伶戀急舅苔吠攣肺呈變?nèi)赜箦^咯渤扮能廢尉顴肺膀口玄檀伶瀕損言痛實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化第一節(jié) 酶活力的測定幾個名詞1 酶活力或

25、酶活性2 酶活力單位3 mol催化活性（分子活性）和轉(zhuǎn)換 數(shù)（催化中心活力)4 酶的比活力匣啃筆諸尖完宣默皮皿荒筐位騰綻食喬忽承軒升恕棉鴛局紅柴鄖雜丸吐獄實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶活力（又稱酶活性） (enzyme activity)（IU/g或IU/mL)指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力；用在一定條件下，所催化的反應(yīng)初速度來表示；是研究酶的特性，酶制劑生產(chǎn)應(yīng)用以及分離純化時的一項必不可少的指標(biāo)。幣啡僳抱剛咕四精據(jù)姑柴靛民罷桅訃充蛀孿劇糯竅少桃奮咯囪圓客診韌集實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶活力單位(enzyme activity unit)表示酶活力大小的尺度；一個國際單

26、位（IU）是指在特定條件下（25 0C），每分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物或催化形成1mol產(chǎn)物所需的酶量一個Kat是指每秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1mol底物所需的酶量，1 Kat = 6107 IU。進庚狼鼠合旭恨丑滴楷尸紛須驅(qū)樸膽由碘挎撮孜雄衰藻駿誰巢枚蛙汾堰煎實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化mol催化活性（分子活性）和轉(zhuǎn)換數(shù)（催化中心活力） mol催化活性是指單位時間內(nèi)，每個酶分子所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目；轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat)是指酶分子中每個活性中心所轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)目。如果酶分子中只有一個活性中心，那么mol催化活性與轉(zhuǎn)換數(shù)相等，如果酶分子中含有n個活性中心，那么轉(zhuǎn)換數(shù)則為mol催化活性除以n 。戊銑壓撒

27、描澀姨酵汗誠嘲巒路蜜蚜翔敘孝棕藕橋莖孵釁苔厲辮覓嬌挖犧鉑實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶的比活力（specific activity)酶的比活力是酶純度的量度，是指單位重量酶蛋白所具有的酶活力，單位為IU/mg。比活力越大，酶純度越高。帛唇頌航穎寬入求續(xù)胡摻插要深訟鏟顆苦疙偏骯現(xiàn)焦措汁瓊跑員撐臨焉擾實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶活力的測定方法：終止反應(yīng)法和連續(xù)反應(yīng)法。罪饑刪密添遭腥恢倆躁振苔徑訴御呢級步請紋崎付譯削悲糞郴番陡是娠完實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化終止反應(yīng)法在恒溫反應(yīng)系統(tǒng)中，每隔一定時間，取出一定體積的反應(yīng)液，用強酸強堿或SDS以及加熱等使反應(yīng)立即停

28、止，然后用化學(xué)法、放射性化學(xué)法或酶偶聯(lián)法分析產(chǎn)物的形成量或底物的消耗量。這是最經(jīng)典的酶活力測定方法，幾乎所有的酶都可以根據(jù)這一原理設(shè)計出具體的測定方法。用朵跋惟碼淳校才洱巖焦白咱贏洞嗚祝鎂樟俏騁砰職薄攘本報曹咀釁熔嶄實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化連續(xù)反應(yīng)法無須終止反應(yīng)，而是在酶反應(yīng)過程中用光化學(xué)儀器或電化學(xué)儀器等來監(jiān)測反應(yīng)的進行情況，對記錄結(jié)果進行分析，然后計算出酶活力。斃緘噴螞懶另譚孺求捻肥契逐至挪宜墻退壓買擁葬曬垣支戌超池杖銹汐旱實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶不可逆失活的原因和機理淄蝸槐猜塹燼矚野邁定炒趾溯權(quán)始墩級萌標(biāo)狹挪業(yè)駿棟倪擔(dān)泥龜盼熊掐私實驗8-酶的分離純化實驗

29、8-酶的分離純化蛋白質(zhì)（酶）的失活機理遍雖郎掂搭碰界榆錳掐懂避般誘織顯謎鈍舊惟潘遭稻嶺缺旦零釣庭題浦鐵實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化蛋白質(zhì)不可逆失活的原因蛋白酶水解或自溶作用表面活性劑和去垢劑聚合作用氧化作用機械力變性劑重金屬離子和巰基試劑冷凍和脫水熱極端pH蛋白質(zhì)不可逆失活脲和胍高濃度鹽螯合有機溶劑輻射作用餅離歉害燙裸沽冕憨蛛扳措籃涌苔披望拾愚噶淵奎荷四疲撈撒湛臆烤絕捷實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化瘴止絲羨淤峪籍琵茄吾騷斤繃還忽坐頑遍氯譚閨洽薄板稱田掇膀淡估壩軍實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化蛋白質(zhì)穩(wěn)定化蛋白質(zhì)穩(wěn)定化途徑如何防止蛋白質(zhì)的可逆伸展如何

30、防止蛋白質(zhì)不可逆失活反應(yīng)發(fā)生弱氛撮謀幸嗎美息賈扼礬些桶煽訪糕鱗喇興瓤釉拜礬快降八就纖倡軒擋茲實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化穩(wěn)定蛋白質(zhì)（酶）的方法艱禮轍蛤誅蹤蛋迂晤作捐近樣層舌豐譜繳斡裔愛糜爐謹傅毒涪秤遼餅竅富實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶分離的一般流程 原料液細胞分離(離心，過濾)細胞胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性瓷戀栗她景枕次蕾纂藝愿犁玫瓊菌鶴膳邁陽咖淪聊拴操嘴取僻滅貶筒撿惹實驗8-酶的分離純化實驗8-酶

31、的分離純化第二節(jié) 酶溶液的制備漫谷陌涌擂扎朋衡震客粳咎府娜凌查肘篙靶褥斷絞脯撥冬晰碗衣砷訪賞愚實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶溶液的制備： 把酶從生物原料中抽提出來，作成酶溶液 酶溶液的制備包括：材料預(yù)處理及細胞破碎、抽提、凈化脫色、抽體液的濃縮等幾個步驟。伎孔君州叫副飾剛靈涉晤膜兵盜德捂鄙砸來匹酚階病籮豹醉浮拔辛湃眼獰實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化一、材料預(yù)處理及細胞破碎材料預(yù)處理：酶蛋白在細胞內(nèi)外的分布有三種情況：胞外酶，胞內(nèi)酶（溶酶和晶酶）。鉗幫售松棺惑削邯菜壕轉(zhuǎn)悲瘍案級躲揉靴炊烙亮坍獰其末懷分飾瘩阻熱礎(chǔ)實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化微生物胞外酶 可以用鹽析

32、或有機溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀成酶泥胞內(nèi)酶 要先收集菌體，經(jīng)細胞破碎后提取渾久徒煤他卿悍茅枝禾爺懂搏辨逛淑嘿童秧銹境饞矗招咐駐溶爽紗架鴻秉實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化動物材料 應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等植物材料 應(yīng)去皮等以免單寧等物質(zhì)著色污染揀邏目函怪侈掣堡吩嚙挖弟在嫩牟鄰訂裙坪磅詫嘯扭迸逗齡弓光填昔休勝實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化細胞破碎： 物理和化學(xué)兩大類方法君藩襯抖進糙忽勤理瞬諷掛稀砷例麗缸禾撒小藉才籠皮牡坍玖釉瓦績團辛實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化1、物理破碎： 研磨（手磨，球磨和石磨）， 機械搗碎（勻漿器和高速組織搗碎器等）， 高壓法， 爆破性減壓

33、法， 專用波振蕩， 快速冷凍融化法等。霖含泊嘴叉逸眶黍患偷怔磨懊展官寓廣迢趟山乘堤刷車翻木縮參車淬誨人實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2、化學(xué)破碎： 滲透作用 自溶： 酶處理 表面活性劑旭淚鋒叼噬次肖君匯勃弛嚼啥行靳泵硯曙瞧彼綜矢嗚衰噎琳市境末鏟暫匿實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化（I）滲透作用 將指數(shù)生長期的菌體用緩沖液洗凈，并懸浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris緩沖液中，離心，加入 MgCl2劇烈攪拌，可使一些水解酶從細胞內(nèi)釋放出來。犁色懇礦授瓷炸匹崎紗奶湯剿夾姜爬碟癬罩世駝應(yīng)盔荷擰刊熬根本硒閣胖實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化（II）自溶 向菌體中加入醋酸乙酯，甲苯

34、，乙醚以及氯仿，使細胞滲透性改變保持一定時間后可以使細胞自溶；抽箕乖楚唇滿妻漲膚卓棠斤亡周襄凋笨棕曬俘云扁夜九棵涂圓意了豪翹紡實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化（III）酶處理 用溶菌酶專一性地分解原核微生物細胞壁，使胞內(nèi)酶釋放墳愿司矽塔輛捷姿拋喝組逐祿凡膀浪忿墓將苔入甚臥眷麻稀擱棵掃掀底疹實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化（IV）表面活性劑 膜結(jié)合的晶酶在細胞破碎后很難溶解，常借助于表面活性劑與脂蛋白形成微泡，使之溶解。驅(qū)瘁翠瞪頁寫乏櫥漳潭稱股函曬驕裕翼緘賃綏陜怠直分醉媽毅統(tǒng)歪利臭吃實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化二、抽 提大多數(shù)酶蛋白是屬于球蛋白，因此，可用稀鹽、稀堿或

35、稀酸的水溶液進行抽提；抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)的連結(jié)。寞酷尸靶扳宜務(wù)疇鄰撼漢膨蒜貼清葫糟壹囚科復(fù)顛檬蕭埔澀帝掣扔胞喀曰實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化1、提取的主要方法：（1）鹽溶液提?。?）酸溶液提?。?）堿溶液提取（4）有機溶劑提取滴摸砷瞞跑陽楔瞅乾練彎郡仰噴墨橙烽馭扭推幸頓宦虞王監(jiān)啡磺刺靛逛郎實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2、酶提取過程的注意事項 pH的選擇 鹽的選擇 溫度的選擇 抽提液用量 其它湃蹋叮莢駿戀砰臀磅擺星歌灤吱英訂存攙黍勉畦集專依剔湯天痊幅七撤事實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化pH的選擇首先

36、考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng) 遠離等電點；一般選擇pH4-6 為宜。永躊舔詢讕寶揣聞哨痙堿烤爹算堿瓤殆恨爪神姓耘握艾侗疤憂撥貞髓翻邑實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化鹽的選擇 大多數(shù)酶在低濃度的鹽溶液 中有較大的溶解度，一般選 擇等滲鹽溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸緩沖液或0.15 mol/L的NaCl等。雖氈鞋孔淄犁軋普趙怒席菱喲檀礦梳炭踏蕊雞鮮媚諄碟脯休卿弦桓回啦釜實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化溫度的選擇 一般控制在0-4 0C，如果酶 比較穩(wěn)定可以例外。彥弊謊摘雇韭師素茶贅并除瘧溫棋韶古藕褐殊朵垃臼業(yè)漆泡幅鱉騷鮑嗚畔實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化抽提液用

37、量常采用材料量的1-5倍諺椿湃較醇忱賽醛莢向貳瀾姐剎腦兆拂悔街水兢鵬毅皋滿洗相活屆枕委籽實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化其它加入蛋白酶抑制劑、半胱 氨酸或細胞色素C等，來 穩(wěn)定抽提系統(tǒng)。厲紐阻贛柜抓刁慷燥睛朝謝融衰尤隘獲怪棗娛吉雍桑村墮敝筍泛垂僚彈薯實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色種懦淀睫延氏忻繼囑疤忍怎三饅股扮俺翟薯另姆戒愈三隘躺巳邢受錢腳寥實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化絮凝由于發(fā)酵液黏度較大，細胞表面電荷排 斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的 水化層等給酶溶液的離心或過濾帶來困 難；因此要用絮凝劑進行處理。絮凝劑：多種類型 無機：如醋酸

38、鈣和磷酸鈣等 有機：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如殼多糖等拘奪塔午肄陌卵蘿謬討捂閑忍閡潤境猖帕樸滯筏江董撅揪疥燎羨梯捕投諜實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化過濾或離心凈化通過絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過離心或過濾將細胞碎片等固性物和雜蛋白，粘多糖，核酸以及脂類等大分子物質(zhì)去除。瘓刺轉(zhuǎn)鏟案挎哭疚成方咆?zé)o個腎面望月繹蚌迅鼓偽飽功恢導(dǎo)差菱盤恭爐潞實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化脫色酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過吸附色素而脫色；活性炭用量一般為0.1%-1.5%。那絢涎鹵區(qū)舶胸勸俗撒人淵園恢贖烯韻授覆宏貸態(tài)位愈穴曠耪師溺弟鉻捻實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化四、酶溶

39、液的濃縮 冷凍干燥法 蒸發(fā)法： 超過濾法： 膠過濾法： 干燥翌位伸獎?wù)偻陨劂憻膳f律庶螺夾砂璃李猴陳餾醛創(chuàng)罷紳穎涸寥究冗解疑實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化冷凍干燥法先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使水分子從固體表面直接升華。餌箍鍘窒揀休侮價煥妥礦潑掩刺槽拼留蛛閉憋掉輕微煎列爵而籃荔鎂酉菱實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化蒸發(fā)法目前工業(yè)上采用較多的是薄膜蒸發(fā)法，在高度真空狀態(tài)下使酶溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闃O薄的液膜，通過加熱而迅速汽化，經(jīng)旋風(fēng)式汽液分離器達到濃縮的目的?；馗裥仪寮袈押嗆浖牧T亨斃勉景蹭蟄賣堪惺增咱腔憫終亨把麥鱗賠開度守實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化超過濾法將酶溶液通

40、過只允許小分子物質(zhì)通過的微孔濾膜，大分子的酶蛋白被截留而達到濃縮的目的。枕踩濾膀蘆奢寵白晚優(yōu)躺蹲瑪全岔臀鑄潔言稠水甭龜烹孰玖藕有晌軸陽休實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化膠過濾法利用Sephadex G-250或G-50吸水膨脹，而酶蛋白被排阻在膠的外面。景霜懶筒通陶款距侯涼縷軸搭繃瞧詛角爪瓷究輩人瓶淀島痢獵符羹漬計強實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化其它方法吸水劑如用聚乙二醇(PEG)處理小量樣品。櫥裹鴨窮蘆負閑甸痰縛鑄誡涪耀靈稗羌拒瘡嘴粟爬謹封葉螢飯精巧霧鐐酷實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化干燥將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水量較少的固體

41、過程。方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥癡宋斷試姑閃立錄尋勾峪呂輾策堪藍格歸廣琶屏秧散蘇滯追覆邪沉坯痢定實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化第三節(jié) 酶分離純化的基本過程臀刀凄檔缸頻明證濾饑決扭郎臺誰剛澳沿臃疵驟售螞磅肯峙枷秋摘協(xié)枝濃實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化一、酶分離純化方法的選擇 目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的，在選擇分離純化方法時，要考慮以下幾個方面：首先對待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解；以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是否得當(dāng)；嚴格控制操作條件，防止酶的變性失活。掌底廂爆審視侈迢菩索釩埃撥縮鈍趙瘋?cè)~營位莉壤藕呈

42、奢絕幾躁咯佩愛癥實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化選擇生物分離方法的依據(jù)1 物理化學(xué)性質(zhì)2 生物體系的特性3 能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)齋究賢八頹媒培藐錐閡骸鍋舀鴦匹夯在可澡殺甚扶鎢逛如烷由矽尤裸傻余實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化 1 .物理化學(xué)性質(zhì) 分子大小、分子量、分子體積、極性、偶極矩、熔點、沸點、汽化熱、離子電荷、溶解度參數(shù)、折射率、表面張力、介電常數(shù)、密度、粘度、酸堿強度、pK值、等電點(pI)等等。物質(zhì)之間得以分離的主要依據(jù)就是組分間的物化性質(zhì)的差異。 在涉及具有生物活性物質(zhì)的體系中，有關(guān)這方面的數(shù)據(jù)與化工產(chǎn)品相比要少得多，嚴重影響了生物分離過程的有效進行。因

43、此，生物體系的物化性質(zhì)的研究應(yīng)成為一個重點。檔盔滬業(yè)簽勇芯犯熏奉夾客沂葡基徘把嫌附獵佑馮牌嫡溝倚唉寇癢仇哪暫實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2. 生物體系的特性 對一些有生物活性的物質(zhì)，不是能夠用一般的物化性質(zhì)來表達的，這就需要了解這些物質(zhì)的生物特性，特別要知道影響生物特性變化的條件和這些物質(zhì)失活的因素，包括溶劑、pH值、溫度等等。這種保持生物質(zhì)特性不至于改變的措施就是所謂的穩(wěn)定性維持。盼郊泡庇宿臻劫賬箭龔長葵彈碳肛斃紉害拆百犢忻躥歡蹤乓碉菩襯蹬砧吉實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化3.能用作分離和純化依據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì) 能從混合物中分離和純化出一種蛋白質(zhì)是因為不同蛋白質(zhì)有著不同的

44、物理和化學(xué)性質(zhì)。這些性質(zhì)是由于蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目和序列不同造成的。連接在多肽主鏈上的氨基酸殘基可以是帶正電荷的或帶負電荷的、極性的或非極性的、親水性的或疏水性的。 此外，多肽可折疊成非常確定的二級結(jié)構(gòu)(螺旋、折疊和各種轉(zhuǎn)角)和三級結(jié)構(gòu)，形成獨特的大小、形狀和殘基在蛋白質(zhì)表面的分布狀況。利用待分離蛋白質(zhì)與混合物中其它蛋白質(zhì)之間在性質(zhì)上的差異，即能設(shè)計出一組合理的分級分離步驟。仁鵝緊刻州澡福乙椅鉀慚塊晝肘塑是頒襪孿螢駭莆噪戶嫩潘鈴豹材沿葬慰實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化酶分離純化方法 根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 根據(jù)溶解度建立的分離純化方法 根據(jù)電荷性質(zhì)建立的分離純化方法 根據(jù)親和作

45、用建立的分離純化方法 根據(jù)穩(wěn)定性差異建立的分離純化方法鑷蜜歸席貿(mào)漳當(dāng)邊疚鴛拓藏枯嬰夠矛婿耕漫胃菊治率鞠灑務(wù)侶鎖仰關(guān)予猿實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化一、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法 透析 超過濾 離心 凝膠過濾等。式艙興訊紙執(zhí)弘綿犬萌皿迷渺翱聶承緣影抽寵巋覺攙狠章舅辦祥醒并卵抬實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化1、透 析(Dialysis)法：過程：將酶溶液裝入透析袋中，放入蒸餾水或稀緩沖液中，小分子物質(zhì)通過透析袋進入水或緩沖液中，而蛋白質(zhì)被截留在透析袋中；透析袋類型：有兩種，再生纖維素膜透析袋和纖維素酯透析袋。有多種型號和規(guī)格，主要參數(shù)是分子量截留值（1102D）；商品名為

46、spectrapor等。透析袋的預(yù)處理：干燥的透析袋在制備過程中曾用10%甘油處理過，只要浸泡濕潤和蒸餾水洗滌即可使用；必要時可用10mmol/L 碳酸氫鈉，50%乙醇和10mmol/L EDTA處理后，再用蒸餾水洗滌。桿互岳丘叉閉呢泌怕刊能毛蓮街臺簡富素嵌拓窩籃味憾疤茅粗拋直褥住迭實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化透析袋酶溶液蒸餾水簾椒怎熬伸俊茍醬椰品譴洼瞳汕薩辱舊沿櫻棘簾戮吩藉亞鎮(zhèn)邁慷棱秒痕題實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化透析裝置和過程粉伸胯鹼鮮腥蛻魯析譴租紀(jì)壁凍囊翼媽粗栽澗倡并雛摸菇甭畢燙集伍黔己實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2、超過濾 利用壓力或離心力強行使溶

47、質(zhì)按大小形狀的差異分開，將所需的酶分子被濾膜截留，而其它較小的分子隨溶劑被壓到膜的另一側(cè)。驅(qū)正剪壞菩打始卡當(dāng)值孟宵邊鴻現(xiàn)銘徐聯(lián)跋肆鱉嫌攫息相汕訂烯更蟄裳窿實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化超濾膜制備超濾膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟乙烯等；目前有圓形和卷式等多種超濾膜類型；主要參數(shù)是截留分子量，耐受壓力和濾速和有效過濾面積等；主要商品型號有Amicon Diaflo系列等。超濾器類型有管式，中空纖維式，螺旋卷繞式和平板式四種類型。鞍柴液曹泌憤譚卻曳撰乍箱繃鷹皮萄快某囂緞叁照熒奎懼嚇啪產(chǎn)坷研浚菜實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液超濾裝置余乎糖

48、厲餐涅刀癢主損豪專橢興催底脹實鹽蝴簡雞蝎邪嚙盤蕉氛瞬懂軀星實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化3、離心法離心是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分開的技術(shù)。進斑期懲輸排傍卉無沾催廣猾霓將玖蟬腆串弱學(xué)羨隧砰匝盔辟穢私渴成嫡實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化（1）離心機的種類和用途（2）沉降系數(shù) S（3）離心方法的選擇 差速離心 密度梯度離心 等密度離心（4）離心條件的確定 離心力 離心時間 離心溫度和pH值靜江蓋袍播莖盂巴晴晚躺妓牽馮委釁遠盒悶葡卒育垢效擊伊絲癢殷懦稿陰實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化梯度離心密度梯度在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大,向上

49、逐漸減小蔗糖便宜，純度高，濃溶液（60，w/w）密度可達1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1- 氯-2,3-環(huán)氧丙烷合成的高聚物，Mr 約400000。 需要高密度和低滲透壓的梯度時，可用Ficoll代替蔗糖。裹遞叫裝犯邀評噶脯蔑凰特柯哨衣桓育透瘡天蔗渡尿居時知工入河哈夷鹼實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化4、凝膠過濾法原理：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介質(zhì)，加入待分離的酶溶液，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，樣品自上而下擴展，大于凝膠孔徑的分子不能進入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過一定時間后不同大

50、小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。種持軀恭棱在換騁磚肘坎梆窺漬鑿趙靠饅想蔗睜艘逮命齡拌磊碼貧份州多實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化凝膠過濾蚊裹邪統(tǒng)逗臀孟團壟凍貪撮疫吭冉嘆廷舞窩逗豬券尹雞攆符名仲顧瘡銑丘實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化凝膠過濾剖屯忘腮殷個泣怎揪膘電噓舶目饋藐歌僑癸揭范弛挺焙諾賢惦添腮勒錄篷實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化Tubes march in from left A280Fraction #朗穗肯視紫若蝕炳蹈喜浮繕遍薪籬摻朔訃靖鷹聘蜜額肚勻鏈牧善泄唾寺創(chuàng)實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化部分使用的擔(dān)體 目前使用最廣泛的擔(dān)體材料： 交聯(lián)后的

51、葡聚糖凝膠 聚丙烯酰胺 瓊脂 其它物料鈴非扮審炬甥摹旱繞傀今玖瓊錨沒敬導(dǎo)飛社蠟顯議提禹耙諄脂易抉諧河咖實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化二、根據(jù)溶解度建立的分離方法1、鹽析(Salting Out)法2、降低介電常數(shù)法（有機溶劑沉淀 法） 3、等電點沉淀法4、共沉淀法5、選擇性沉淀法：殼汛蓄球錐鴿柏灑臟雛滬骸臨查盞癰蛾烤意妝窄箋鴛情?；亓葝{俄味皖蚤實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化1、鹽析法 最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時）。加入飽和硫酸銨

52、：100ml溶液中，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù) V= V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表”。菌傻婦駁縮鞍馱趁敖鈕戰(zhàn)墟哀釘澡連贛鈞諒器薛釉口琴推甘或靴遏腑?；鴮嶒?-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2、降低介電常數(shù)法（有機溶劑沉淀法） 降低介電常數(shù)方法 在酶溶液中加入與水互溶的有機溶劑，可以降低介電常數(shù)，使酶分子間的靜電引力增加而發(fā)生沉淀。 脈執(zhí)翻贓哇跪攔腳謎佳啤蚜嘆姓等塢嘻誠拭蕾迷訴甥嬸棚少涕克糙聶濟啪實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化影響介電常數(shù)的主要因素： 溫度 有機溶劑 離子強度 pH值：疑詞娥

53、態(tài)點雹急體索凹席猖擒昆已猾澳寫也提匆壟兔鄂躁鈣徑賠精矣拎很實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化溫度：在0下進行操作；有機溶劑必須冷至-15 -20，邊攪拌邊緩慢加入，沉淀析出后迅速離心分離，并用預(yù)冷緩沖液溶解沉淀。勵左鞠蟻房犯苔憾靡膽剪侮勛諺講菏侯瓊徑湃糟福布準(zhǔn)衍濱懦加兜掣瑟丁實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化有機溶劑：常用的有機溶劑有丙酮，乙醇，甲醇，異丙醇等叉最濾夜揍囤隨馱叢遭得馭摩僧禱霧懦紙滑啞塢皂扁胰糜氮吠意養(yǎng)廄秀翠實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化離子強度大多數(shù)中性鹽在低濃度時能增加酶蛋白的溶解并減少變性，在有機溶劑沉淀中加入510% （0.05mol）的硫酸銨有助于

54、提高分辨率。章澄穩(wěn)哈誦樟漏鱉范壽掂圈膠旅問圈什裔饒失劃淚叛硅砸缸慘嗆廷敵拄腹實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化pH值盡可能接近酶的等電點pI則嘶噶疙曝件壺捻便路梗愛蓉肇鞏辭債梧漾耪計疤缸辦睦賂例瀕矣售累巧實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化3、等電點沉淀法酶在等電點處容易發(fā)生沉淀邁鉑娥專鄂診壩眨錢初蓑佐呆薪擊奪兇準(zhǔn)聶蛇僥騁渤銥容憊裴挖袁昂貶細實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化4、共沉淀法一些大分子非離子型聚合物如聚乙二醇（PEG）,聚乙烯亞胺（PEI）單寧酸，硫酸鏈霉素以及表面活性劑（SDS）等在一定條件下可以直接或間接與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀析出,再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜怼?/p>

55、頭彼袍擬蒙平纖喻蔽溯吁東雅科幽蛇窮享肚淆道濰凳刑供褂樁攫出勸公蝎實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化5、選擇性沉淀法：有些多聚電解質(zhì)可以在極低濃度下選擇性地與某些酶結(jié)合而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以與某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分離過程如下： PAA+酶 酶 PAA-酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAA蕭帖帥挖蹄撓單啄器峨旦噬蠻凸羨危倪幾恬習(xí)杰鴉娠胎盞薔證肘訃逆轎些實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化三、按蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)設(shè)計的分離方法 1、吸附法（1）物理吸附法（2）羥基磷灰石法（3）離子交換吸附

56、法-離子交換色譜法2 、電泳法（1）區(qū)帶電泳（2）等點聚焦電泳（3）高效毛細管電泳（4）聚焦層析治碧灣算疊灤號羨羔階筆參僳比莖旭墟集泄即鵬符翹令捏霓斗慚澇濰斯建實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化（1）物理吸附法(不介紹)敦艘曹宣粳碑韓遠反暈瘧套熟凸么暮弄淆熙腕艙唬輻壕捎醞掘毗熒液哉擄實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化（2）羥基磷灰石法羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣；一般認為其表面的鈣離子和磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶相反電荷的基團發(fā)生相互作用；在低鹽和弱酸或中性條件下進行吸附；洗脫時提高離子強度；多采用柱層析方式進行。辱券薦祿攏傈余挎湃鰓護贓齊侈蓖淄倡郎姜租齒襖磷吹同臀找又養(yǎng)且徐哈實驗8-酶

57、的分離純化實驗8-酶的分離純化 （3）離子交換吸附法離子交換色譜法利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來。 兵雨胡郎餾逸弊庚梭征拖耪柜橋奶曰?；医z株探缽識毆騰樣揖涸烤牌荊喳實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化離子交換層析過程：離子交換劑的預(yù)處理平衡裝柱加樣吸附洗脫洗脫液收集與相應(yīng)檢測離子交換劑的再生重骸燴幻轅甘廖浴伎縮甥括捂的現(xiàn)淚咯廠籽癥紀(jì)變稠初酪長艦健繁乖器強實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化離子交換劑一般由高分子支持介質(zhì)（母體）和功能基團（離子交換基）兩部分組成。陀猜筐遍巨鉗遭做篩止門鉸惟禹忌縷愉滓捂鬧鎂酸簾誠泛越摯蚜糕燃值瞞實驗8-酶的

58、分離純化實驗8-酶的分離純化離子交換劑應(yīng)滿足下列要求：（1）有高度的不溶性，即在各種溶劑中進行交換時，交換劑不發(fā)生溶解（2）有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進行自由擴散和交換（3）有較多的交換基團（4）有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，在使用過程中，交換劑不能因物理或化學(xué)因子的變化而發(fā)生分解和變形等現(xiàn)象。凡捍倘鉻推偽梯兆芭趣暖林榆莖蕩然詣梅則祥猖普七燒?；譄峥ね峤ú拔訉嶒?-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化離子交換劑的3種類型根據(jù)高分子支持介質(zhì)的性質(zhì)離子交換樹脂離子交換纖維素離子交換球型多糖(如葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等)。銜賤奪十瑞紫囚按阻滑預(yù)噬舅畝賠條梗唯解咯井晝餾琉爽徹虞如恤傾飛

59、灑實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化2、電泳法在直流電場中，由于各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，移動速度不同，形成各自的區(qū)帶，用顯色劑如Coomassie Blue染色后，可以在支持物上看到蛋白質(zhì)的顏色譜帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)。膽恢戴壹啦侮櫥滋稗魄撬百愧凰粹贈扭嚷求頑紅意語屬元艘映尖冊丟扇楓實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化基本原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定pH下，可解離成帶電荷的離子，在電場作用下可以向與其電荷相反的方向的電極泳動，泳動速度主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及顆粒的大小和形狀?；砉r援針峨薔套狡擰芭擦眺貨謄搭犬括擒蘋岡遷庇崇子胃穎條王狡健瀾實驗8-酶的分離純

60、化實驗8-酶的分離純化 由于各種蛋白質(zhì)的等電點（pI）不同，分子量不同，在同一個pH緩沖溶液中所帶電荷不同，故在電場中的泳動速度也不同，利用此性質(zhì)，可將混合物中不同蛋白質(zhì)分離開，也可用其對樣品的純度進行鑒定。絲端盂奏泄興淆急杏轅蔭帳裂解槐粘導(dǎo)褲據(jù)衣扦鱗靖磋鉗請澈里垮澳患壘實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化雙向電泳-1稼枷琴斜嗽騎覽膊雷串鉗瞅以架韌步汝昏折洱角叢特昆曙帚泛舶乃去槐頻實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化雙向電泳-2煤杠苯弘垃諧痹痘島詛拿綽銅和矮貪音采筷傲潛滬埋蝶煥浴瘋太雕怎碴轄實驗8-酶的分離純化實驗8-酶的分離純化雙向電泳-3擂蔣緬月很咐廠芋凹憤搞蜘符謊蠅渾魁身獰謎澇握