臨床免疫學與檢驗：第九章 酶免疫技術

1、酶免疫技術Enzyme Immunotechnique第一節(jié) 概述酶免疫技術的原理酶及其底物酶標記抗體（抗原）的方法酶標記物的純化與鑒定 固相酶免疫測定儀酶免疫技術的類型一、原理酶免疫技術是以酶標記的抗體（或抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應的特異性和酶高效催化反應的專一性相結合的一種免疫檢測技術。將酶與抗體（或抗原）結合成酶標記抗體（或抗原），此結合物既保留抗體（或抗原）的免疫學活性，又保留酶對底物的催化活性。在酶標抗體（或抗原）與抗原（或抗體）的特異性反應完成后，加入酶的相應底物，通過酶對底物的顯色反應，對抗原（抗體）進行定位、定性或定量的測定分析。二、酶及其底物（一）酶的選擇要求（二）常

2、用的酶（三）常用的底物（一）酶的選擇要求一個酶蛋白分子每分鐘可催化103104個底物分子轉變成有色產(chǎn)物。用酶標記抗體（或抗原）建立酶免疫測定法，可使免疫反應的結果得以放大，保證測定方法的靈敏度。用于標記的酶應符合的條件 酶活性高，能對低濃度底物產(chǎn)生較高的催化反應率。具有可與抗原、抗體共價結合的基團，標記后酶活性保持穩(wěn)定，而且不影響標記抗原與抗體的免疫反應性。酶催化底物后產(chǎn)生的信號產(chǎn)物易于判定或測量，且方法簡單、敏感和重復性好。用于標記的酶應符合的條件酶活性不受樣品中其他成分（內源性酶、抑制物）的影響；用于均相酶免疫測定的酶還要求當抗體與酶標抗原結合后，酶活性出現(xiàn)抑制或激活。酶、輔助因子及其底物

3、均對人體無危害，理化性質穩(wěn)定，且價廉易得。（二）常用的酶辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 堿性磷酸酶（alkaline phospharase，AP） b-半乳糖苷酶(b-galactosidase，b-Gal ) 其他的酶 1辣根過氧化物酶（HRP）HRP因在蔬菜植物辣根中含量最多而得名。它是由糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅素（輔基）結合而成的復合酶，分子量約40kD，等電點為pH5.59.0。主酶為無色蛋白，最大吸收光譜為275nm，輔基是酶的活性中心，最大吸收光譜為403nm。HRP的質量常以純度（Reinheit zhal，RZ）和活性來表示。HRP的純

4、度以A403nm/A275nm的比值表示，RZ值越大，酶的純度越高。用于酶免疫技術的HRP，其RZ應3.0。HRP的活性則用單位表示，用鄰聯(lián)茴香胺法測定時，在25條件下1min將1g底物轉化為產(chǎn)物的酶量為一個單位（U）。酶的純度并不代表酶的活性，因此選用酶不僅要選純度高，而且還要選活性強的酶。2堿性磷酸酶（AP） 是一種磷酸酯的水解酶。因其分子量較大（80100kD），不易透入細胞內，故很少用于E I H，但因其敏感性高、空白值低，也常用于E I A。3.半乳糖苷酶(b-Gal )b-Gal源于大腸埃希菌，分子量540kD，最適作用pH6-8。因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標記物在測定時不易受

5、到內源性酶的干擾，因此也常用于均相酶免疫測定。4其他的酶常用于 E I H 的還有葡萄糖氧化酶（GOD），以及用于均相酶免疫測定的6-磷酸葡萄糖脫氫酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等。（三）常用的底物1HRP的底物2AP的底物3. 半乳糖苷酶底物4GOD的底物 1HRP的底物 HRP的底物為過氧化物和供氫體（DH2）（1）過氧化物： H2O2（2）供氫體：鄰苯二胺（OPD）;四甲基聯(lián)苯胺（TMB）表20-1 HRP常用的供氫體底物及其反應產(chǎn)物。供 氫 體 底 物反 應 產(chǎn) 物終 止 劑測讀波長二氨基聯(lián)苯胺 (diamido-benzidine,DAB)棕色、不溶性24mol/L492nm聯(lián)苯胺 (be

6、nzidine)藍色、不溶性HCL或H2SO4450nm鄰苯二胺(o-phenylenediamin,OPD)黃色、可溶性同上450nm四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethyl-benzidine,TMB)藍色(黃色)、可溶性同上460nm四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽 (TMBS)藍色、可溶性3mol/L460nm5-氨基水楊酸 (5-aminosalicylic acid,5-ASA)棕色、可溶性NaOH550nmABTS (2,2-azino-bis(3-ethyl benzithiazoline-6-sulfonic acd)綠色、可溶性1%SDS405nm2AP的底物常用的為對-硝基

7、苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，PNP），其反應產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，測讀波長為405nm。3. 半乳糖苷酶底物常用底物為4-甲傘酮基-b-D-半乳糖苷(4-methylumbellifery1-b-D-galactoside，4MUG)，酶作用后，生成高強度熒光物4-甲基傘形酮 (4-methylumbelliferone，4MU)，其敏感性較HRP者高3050倍，但測量時需用熒光計。4GOD的底物為葡萄糖，供氫體為對硝基藍四氮唑，反應產(chǎn)物為不溶性的藍色沉淀。三、酶標記抗體（抗原）的方法戊二醛交聯(lián)標記法 改良過碘酸鈉標記法 四、酶標記物的純化與鑒定酶標記物的純化 酶

8、標記物的鑒定 （一）酶標記物的純化常用的純化方法有:葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純（二）酶標記物的鑒定 1質量鑒定 常用免疫電泳或雙擴散法。出現(xiàn)沉淀線表示酶標記物中的抗體（抗原）具有免疫活性。沉淀線經(jīng)生理鹽水反復漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀線上能顯色，表示酶標記物中酶的活性仍保留。也可直接用ELISA方法測定。2酶標記率的測定 常用分光光度法分別測定酶標記物中酶和抗體（抗原）蛋白的含量，再按公式計算其標記率。（1）酶含量： 即酶在403nm波長的A值為1時，酶的含量為0.4 mg/ml。（2）IgG含量 即酶蛋白（0.3）結合戊二醛后A值為0.42；

9、抗體蛋白與醛化酶結合后A280nm約增加6%，故乘以0.94；兔IgG的A280nm=1.0時， IgG含量為0.62。（3）克分子比或摩爾比(E/P)： E/P一般為1-2（4）酶標記率：或一般酶量為 1 mg/ml、 HRP/IgG 在1.52.0之間、酶的標記率大于0.3時，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的結果最好。五、固相酶免疫測定儀（一）性能指標1.測定波長 2.測定的吸光度范圍 3.光學系統(tǒng) 4.檢測速度 5.震板功能 6.溫育功能 7.軟件功能 （二）儀器類型1. 微孔板固相酶免疫測定儀2.管式固相酶免疫測定儀 3.小珠式固相酶免疫測定儀 4.微粒固相酶免疫測定儀 5.磁微粒固相

10、酶免疫測定儀 （一）性能指標1.測定波長450nm和492nm 兩個波長是ELISA法最常用的。除了這兩個基本濾片外，由于雙波長比色的需要，還應配有620nm和405nm波長的濾光片。2.測定的吸光度范圍酶標儀的吸光度測定范圍在02.5之間就可以滿足ELISA測定的需要?，F(xiàn)在酶標儀一般拓寬至3.5以上，并能保持很好的線性和精密度。3.光學系統(tǒng)酶標儀光學系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道檢測，一般為硅光管或光導纖維，除測定通道外，有的酶標儀還有一個參比通道，每次測定可進行自我校準。酶標儀的光學系統(tǒng)功能如何，均是通過酶標儀測定的吸光度、線性、精密度和準確度等指標體現(xiàn)出來的。4.檢測速度酶標儀檢測速度是指其

11、完成比色測定所需要的時間。速度快利于提高檢測的準確性，避免因時間不同所致的各微孔之間吸光度的差異。目前生產(chǎn)的酶標儀檢測速度均較快，一般在數(shù)秒內即可完成全部測試。5.震板功能 酶標儀的震板功能是指酶標儀在對ELISA板孔進行比色測定前對其進行震蕩混勻，使板孔內顏色均一，避免沉淀對測定的影響。6.溫育功能 溫育功能是酶標儀的一個附加功能，是指酶標儀本身能按要求自動精密地控制儀器內部的溫度，使得ELISA微孔板條的溫育過程可在儀器內部進行，而無需再配置溫箱。7.軟件功能 軟件功能是指酶標儀所具有的對ELISA定性和定量測定進行統(tǒng)計分析并報告結果的功能。在ELISA定性測定中，酶標儀若具有陽性判斷值（

12、Cut-off）和測定“灰區(qū)” 的統(tǒng)計計算功能。 在ELISA定量測定中，則在酶標儀的軟件功能中應有曲線回歸方程計算功能。其他功能如質控記錄、質控曲線、數(shù)據(jù)保存等可根據(jù)需要而定。（二）儀器類型由于測定所用的固相載體的不同，各種ELISA分析儀在設計和結構上有很大差異。1. 微孔板固相酶免疫測定儀器國際上微孔板式ELISA使用的載體為96孔板，采用直接對板孔測定吸光度（A）的比色計，稱為ELISA測讀儀（ELISA reader）。這種對微孔板ELISA試劑通用的儀器20世紀80年代初期即有商品問世，經(jīng)過不斷改進，已發(fā)展為自動化、高效率、高精密度的測定儀。解決了ELISA中的洗滌步驟繁瑣不易標準

13、化的問題。全自動酶免工作站全自動酶免分析儀 1 套酶免前處理 START FAME24/20全自動酶免分析儀（后處理）2.管式固相酶免疫測定儀器1990年德國寶靈曼公司（Boehringer Mannheim）推出了全自動管式ELISA分析系統(tǒng)，ES-300儀器。法國Bio-Mereux公司生產(chǎn)的Vidas是一種特殊形狀的管式全自動ELISA的分析儀，配套使用一個特別的“試劑條” 。法國VIDAS-12全自動酶免疫熒光分析儀3.小珠式固相酶免疫測定儀器珠式固相的特點是均一性優(yōu)于板孔；易在容器中成批包被；洗滌時可在洗液中滾動，效果更好。小珠表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積增大，利于包被和增加單位面積的反

14、應量。早年美國Abbott公司生產(chǎn)的珠式半自動ELISA儀器稱為Quantum。目前IMX自動分析系統(tǒng)和Roche公司推出的珠式全自動ELISA分析儀Cobas Core I、Cobas Core II等實驗室使用較多。Abbott,珠子包被酶標儀Quantum Roche公司,珠式全自動ELISA分析儀Cobas Core II4.微粒固相酶免疫測定儀器用微粒作為固相載體具有一定的優(yōu)越性，但其與液相的分離較為困難，一般需經(jīng)過復雜的離心步驟。美國Abbott公司的IMx自動酶免疫分析儀。 美國Abbott公司的IMx自動酶免疫分析儀 5.磁微粒固相酶免疫測定儀器磁微?？捎么盆F吸引與液相分離，是

15、免疫測定中較為理想的固相載體，現(xiàn)已廣泛應用于各種固相免疫測定中。 瑞士Serono公司，Serozyme分析系統(tǒng)。 六、酶免疫技術的類型 酶免疫技術按實際用途分為:酶免疫測定（enzymeimmunoassay，EIA）酶免疫組織化學（Enzyme immunohistochemistry technique，EIHCT）圖20-1 酶免疫技術分類（一）均相酶免疫測定基本原理：酶標抗原(Ab-E)和非標記抗原(Ag)具有相同的與限量抗體(Ab)競爭結合的能力。而Ab-E與Ag結合形成Ag-Ab-E后，其中的酶( E ) 活性將被減弱或增強。因此，不需對反應液中的AgAb-E和Ab-E進行分離，

16、直接測定反應系中總酶活性的變化，即可推算出被測樣品中Ag的含量。均相酶免疫測定主要用于小分子激素和半抗原(如藥物)的測定。 方法類型：1.酶增強免疫測定技術2.克隆酶供體免疫分析1.酶增強免疫測定技術（enzyme-mutiplied immunoassay technigue, EMIT)基本原理：Ag-E與Ab結合形成Ag-EAb后，所標的酶(E)因與Ab接觸緊密，空間位阻影響了酶的活性中心，酶活性受到抑制(圖20-2)。同時加入未標記抗原(標準或樣品中的Ag)，Ag即與Ag-E競爭結合反應系統(tǒng)中限量的Ab形成AbAg，從而使反應液中Ag-E Ab (酶活性被抑制)的比例減少，具酶活性的游

17、離Ag-E增多。因此，最終測得的酶活性隨著反應體系中未標記抗原(Ag)濃度的升高而增強。2.克隆酶供體免疫分析 (cloned enzyme donor immunoassay，CEDIA)基本原理：DNA重組技術可分別合成某種功能性酶(如b-D-半乳糖苷酶)分子的兩個片段，大片段稱為酶受體(EA)，小片段稱為酶供體(ED)。單獨的EA和ED均無酶活性，但在一定條件下可結合形成具酶活性的四聚體。CEDIA即是用ED標記抗原(Ag-ED)，反應系統(tǒng)中再加入相應的EA、Ab及樣品抗原Ag (未標記)，反應時由于抗原抗體間的親和力大于ED與EA，因此Ag-ED和Ag易與Ab結合形成復合物。而AbAg

18、-ED中的Ag-ED由于空間位阻的干擾不能與EA結合，而游離的Ag-ED則可與EA結合成具活性的全酶。由于反應屬競爭結合，故反應液中游離的Ag-ED隨著未標記Ag量的增多而增加，使最終加入底物后測得的酶活性高低與樣品Ag含量成正比 。（二）異相酶免疫測定異相酶免疫測定是目前應用最廣泛的一類標記免疫測定技術?；驹恚嚎乖贵w反應平衡后，需采用適當?shù)姆椒ǚ蛛x游離的和與抗原(或抗體)結合形成復合物的酶標記物，然后對經(jīng)酶催化的底物顯色程度進行測定，再推算出樣品中待測抗原(或抗體)的含量。方法類型：異相液相酶免疫測定固相酶免疫測定1.異相液相酶免疫測定該方法主要用于檢測樣品中極微量的短肽激素和某些藥物

19、等小分子半抗原，近年來的發(fā)展使其靈敏度可達ng至pg水平，與放射免疫測定相近。但因酶標記物具更好的穩(wěn)定性，且無放射性污染，故近年應用廣泛。2.固相酶免疫測定固相酶免疫測定(solid phase enzyme immunoassay，SPEIA)，是利用固相支持物作載體預先吸附抗原或抗體，使測定時的免疫反應在其表面進行并形成抗原抗體復合物，洗滌去除反應液中無關物質并加入酶底物后，通過測定固相載體上的酶標記物催化底物生成的有色產(chǎn)物，確定樣品中抗原或抗體的含量。目前應用最廣泛的是以聚苯乙烯等材料作固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。 第二節(jié) 酶免疫組織化學技術enzyme immunohis

20、tochemistry technique酶免疫組化技術（EIHCT）是在一定條件下，應用酶標抗體（抗原）與組織或細胞標本中的抗原（抗體）發(fā)生反應。如組織或細胞中含有相應抗原（抗體），二者結合形成的抗原抗體復合物中所帶酶分子遇到底物時，催化底物產(chǎn)生顯色反應，在光鏡和電鏡下，就可識別出標本中抗原（抗體）的分布位置和性質；經(jīng)圖像分析也可達到定量的目的。 EIHCT主要用于標本中抗原（抗體）的定位和定性檢測。常用的標本有組織切片，組織印片和細胞涂片等。最常用的酶是HRP，供氫體是DAB。EIHCT可分為酶標記抗體免疫組化技術、非標記抗體酶免疫組化技術和酶免疫電鏡技術三種類型。一、酶標記抗體免疫組化技

21、術（一）原理（二）技術類型及要點（三）方法評價（一）原理酶標記抗體免疫組化技術是借助交聯(lián)劑的共價健將酶連接在抗體（抗抗體）上，酶標抗體（抗抗體）與標本中相應抗原或抗原抗體復合物反應后，再經(jīng)酶對底物的催化作用，形成有色沉淀物，對標本中的抗原進行定性和定位的檢測。（二）技術類型及要點1.直接法 用酶標抗體直接與標本中的相應抗原反應，形成酶標抗體-抗原復合物，最后加酶底物顯色，鏡檢即可。其技術要點包括：室溫下將標本用0.3H2O2和80甲醇液處理15min，以消除內源性過氧化物酶，石蠟切片需常規(guī)脫蠟，用胰酶消化（37），然后用PBS洗；用10牛血清白蛋白溫育標本片15 min，以封閉非特異性結合點；

22、加適當稀釋酶標記抗體，濕盒內37溫育30 min或4過夜，PBS洗去未結合物；加底物顯色，在光鏡下觀察結果。2間接法 用已知抗體（Ab1）與標本中相應抗原（Ag）反應，形成Ag-Ab1復合物，再用酶標記抗抗體（Ab2*E）與Ab1-Ag反應使之形成Ag-Ab1-Ab2*E復合物后，加底物顯色，鏡檢即可。其技術要點包括：同直接法；加適當稀釋Ab1（如鼠抗X），濕盒內37溫育30 min或4過夜，PBS洗去未結合Ab1；加適當稀釋酶標抗抗體（如羊抗鼠），濕盒內37溫育30 min，PBS洗滌；加底物顯色，光鏡下觀察結果。3酶標抗體三步染色法 為間接法的改良法，是在標本抗原上加三層抗體；后二層抗體均

23、可用酶標記抗體，使之形成Ag-Ab1-Ab2*E-Ab3*E復合物。該法由于所形成的復合物中酶的增加，而使敏感性得到了提高。其技術要點包括：同間接法；加第二種酶標抗抗體（如兔抗羊），溫盒內37溫育30 min，PBS洗；加底物顯色，光鏡下觀察結果。（三）方法評價1直接法 優(yōu)點：操作簡便、快速、特異性強，非特異顯色低；缺點：一種酶標抗體只能檢測一種特異性抗原，敏感性低于間接法。2間接法 優(yōu)點：用一種酶標記抗抗體與多種特異性抗體結合，可檢測多種抗原，實用性與敏感性均強于直接法；缺點：敏感性低于非標記抗體酶法與三步法。3酶標抗體三步染色法 優(yōu)點，敏感性強于直接法與間接法；缺點：操作繁鎖、費時。二、非

24、標記抗體酶免疫組化技術（一）原理（二）技術類型及要點（三）方法評價（一）原理該技術首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結合形成復合物，然后利用第2抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3的Fc段結合，又可與結合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結合，經(jīng)酶分子催化底物的顯色反應，達到對抗原的檢測。（二）技術類型及要點1酶橋法 用HRP免疫動物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經(jīng)Ab2（如羊抗兔）作橋，將結合在組織抗原上的Ab1（兔抗）與Ab3連接起來，最后將HRP與Ab3結合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復合物，加底物顯色。2PAP法 即過氧

25、化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良法，技術要點基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（Ab3）與酶制成了復合物（PAP)。3雙橋PAP法 該法是PAP法的改良法，通過兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag- Ab1-Ab2-Ab3- HRP -Ab2-Ab3- HRP，即Ag-Ab1- Ab2-PAP- Ab2-PAP復合物，在抗原抗體復合物上結合了比PAP法更多的酶分子，增強了方法的敏感性。技術要點與PAP法相似。4APAAP法 是用AP代替HRP建立的 堿性磷酶酶（AP）-抗堿性磷酶酶 （AAP）法，簡稱APAAP法。（三）方法評價由于酶不是標記在抗體上，而是經(jīng)抗原（酶）抗體反應

26、與抗酶抗體結合，避免了酶標抗體的缺點，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAP法是當今免疫組化技術中敏感性較高的方法。該技術既可用于抗原的檢測，又可檢測抗體。隨著PAP與雙橋PAP法的完善與成熟，酶橋法已較少應用。三、酶標記免疫電鏡技術該技術是用酶標抗體與組織或細胞抗原發(fā)生異性結合，加酶底物產(chǎn)生顯色反應，在電鏡下觀察顯色反應的強度；它是將電鏡的高分辨力與酶免疫技術的特異性相結合，在亞細胞和超微結構水平上對抗原物質進行定性分析的一種高度精確、靈敏的方法。首選的技術類型是PAP法，電鏡標本的制備分為PAP包埋前和PAP包埋后染色法兩種。最常用的酶是HRP，其底物常用DAB，DAB在HRP催化下形成吩嗪

27、衍生物，經(jīng)OSO4處理后變?yōu)殇~黑，電子密度高，很適合電鏡觀察。HRP的分子量（40KD）較小，易進入細胞內。該技術主要用于有電鏡的科研單位。第三節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzyme-linked Immunosorbent Assay ,ELISA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)于1971年分別由瑞典學者Engrall和Perlmann，荷蘭學者Van Weeman和Schuurs報道。創(chuàng)建了運用酶標記免疫技術進行液體標本中微量物質測定的實驗方法。ELISA基本原理其是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預先結合到某種固相載體表面；測定時，將受檢樣品(含待測抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按一定程序

28、與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應形成抗原或抗體復合物。ELISA基本原理反應終止時，固相載體上酶標抗原或抗體被結合量(免疫復合物)即與標本中待檢抗體或抗原的量成一定比例；經(jīng)洗滌去除反應液中其他物質，加人酶反應底物后，底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中測物質含量。二、方法類型及其反應原理1.雙抗體夾心法 2.間接法 3.競爭法 4.捕獲法 5.其他ELISA 1.雙抗體夾心法2.間接法 3.競爭法 4.捕獲法5.其他ELISA應用生物素-親和素放大系統(tǒng)(biotin-advdin system，BAS)的ELISA 利用酶催化底物發(fā)熒光的酶

29、聯(lián)免疫熒光測定(enzyme linked immunfluorecence assay，ELFIA)斑點-ELISA (dot-ELISA)酶聯(lián)免疫電轉移印跡法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB)酶聯(lián)免疫化學發(fā)光測定(enzyme linked immunochemiluminescence assay，ELICLA)等 三、技術要點固相載體免疫吸附劑最佳工作濃度的選定 （一）固相載體1.固相載體的要求2.固相載體的種類和選擇1.固相載體的要求理想的固相載體應具備如下特點：與抗體(抗原)有較高的結合容量，且結合穩(wěn)定極少脫落；可結合抗原

30、或抗體免疫反應物，以及如親和素或鏈霉親和素等大分子蛋白質；生物大分子固相化后仍應保持活性，而且為有利于反應充分進行，最好其活性基團朝向反應溶液；固相化方法應簡便易行、快速經(jīng)濟。2.固相載體的種類和選擇1）塑料制品 ：聚苯乙烯、聚氯乙烯2）微顆粒 : 磁性微粒3) 膜載體 ：硝酸纖維素膜 NC、玻璃 纖維素膜、尼龍膜 (二) 免疫吸附劑免疫吸附劑是指與固相載體結合的抗原或抗體。 包被：將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)。封閉：用1%5%牛血清白蛋白或5%20%小牛血清等包被一次此過程稱為封閉(blocking)。（三）最佳工作濃度的選定1.方陣（棋盤）滴定法選擇包被抗原的工作濃度

31、 2.酶標抗抗體工作濃度的選擇3.方陣（棋盤）法選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度 四、方法評價ELISA具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強、實驗設備要求較簡單、應用范圍廣泛、無放射性同位素污染等優(yōu)點，可對多種物質進行定性及半微量、微量、超微量定量分析，為臨床診斷和基礎研究可提供可靠的實驗依據(jù)。目前已成為普及應用最廣、發(fā)展最快的免疫學實驗技術之一。第四節(jié) 膜載體的酶免疫測定固相膜免疫測定(solid phase membrane-based immunoassay)與固相酶免疫測定(ELISA)相類似，其特點是以微孔膜作為固相。標記物可用酶和各種有色微粒子，如彩色膠乳、膠體金、膠體硒等，以紅色的膠體金最為常用。固相膜的特點在于其多孔性，像濾紙一樣。方法類型：免疫滲濾試驗(immunofi