微生物實驗課件：實驗六 抗菌藥物敏感試驗（二）-常量肉湯稀釋法

1、實驗六：抗菌藥物敏感試驗（二）常量肉湯稀釋法一、目的與要求1.熟悉常量（宏量）肉湯稀釋法（macrodilution test）的原理、操作方法、結果判讀和臨床意義。2.了解常量肉湯稀釋法的注意事項。二、器材和抗菌藥物1.菌株 待測的大腸埃希菌2.抗菌藥物 慶大霉素原液（4000g/ml）。3.實驗器材 無菌生理鹽水、接種環(huán)、無菌試管、無菌移液管、洗耳球等。4.培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯（以水解酪蛋白胨肉湯最好）。三、步驟和方法1.原理 用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，將抗菌藥物作不同濃度的倍比稀釋，然后接種待測菌，定量測定抗菌藥物抑制該菌生長的最低濃度（minimal inhibitory concentratio

2、n，MIC）。2.方法1）排列試管：排列15支試管于試管架上，除第一支外（抗菌藥物原液4ml），每管加入營養(yǎng)肉湯2ml。2）慶大霉素的倍比稀釋：從第1管中用無菌移液管吸取慶大霉素原液2ml于第2支試管中，混勻后從第2支試管中吸取2ml液體于第3支試管中，依次類推至第14支試管混勻后，吸取2ml液體棄去，第15管不加抗菌藥物。這樣抗菌藥物的最終濃度含量依次為：4000、2000、1000、500、250、125、62、31、15、7.5、3.8、1.9、0.95、0.48g/ml。3）待測菌株的稀釋：將待測的大腸埃希菌制成0.5麥氏單位后進行1:100稀釋相當于1.5106cfu/ml濃度的菌懸

3、液。稀釋完以后最好15min內接種。4）加菌懸液：從第2支至第15支試管，每一支試管中加入0.1ml的菌懸液，混勻后，置35培養(yǎng)1824h后觀察結果。第1支試管不加菌懸液作為不生長對照（陰性對照），而第15支試管不加抗菌藥物作為生長對照（陽性對照）。3.結果判別 以無肉眼可見細菌生長的抗菌藥物的最低濃度即為該抗菌藥物對待測菌最低抑菌濃度（MIC）。（培養(yǎng)基清晰無細菌生長）記錄為：慶大霉素對該大腸埃希菌的最小抑菌濃度MIC為：1.9 g/mlMIC法操作步驟 試管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 營養(yǎng)肉湯 (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

4、 2 2 2 2 抗菌藥物(ml) 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 棄去菌懸液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1抗菌藥物濃度4000 2000 1000 500 250 125 62 31 15 7.5 3.8 1.9 0.95 0.48（g/ml） 預試驗結果 清 清 清 清 清 清 清 清 清 清 清 清 渾 渾 渾以肉眼觀察無菌生長管為最低抑菌濃度（MIC）結果報告： MIC （g/ml ）四、影響結果的因素1.培養(yǎng)基的pH、抗菌藥物的質量、接種細菌的濃度、孵育的溫度和時間、無菌操作等均對結果觀察有影響。2.同時用質控菌株做平行試驗，以評價整個實驗過程每一個環(huán)節(jié)。五 、注意事項 1.在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，質控菌株的MIC值是否處于質控范圍。2.如果出現(xiàn)跳管現(xiàn)象（在連續(xù)幾支清晰的無細菌生長培養(yǎng)管的中間出現(xiàn)12支有細菌生長的渾濁培養(yǎng)管或在連續(xù)幾支有細菌生長的渾濁培養(yǎng)管中間出現(xiàn)12支無細菌生長的培養(yǎng)管），應檢查：培養(yǎng)物純度、操作過程中的其他細菌污染、加待測菌懸液的量、倍比稀釋的操作等因素，應重復試驗。六、臨床意義1.可以測定某種抗菌藥物最小抑菌濃度（MIC）2.對于K