上海等級(jí)考基因工程限制酶的選擇與使用專題訓(xùn)練

1、_、基因工程三大工具1、限制性核酸內(nèi)切酶一一剪刀定義：可以識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶,簡(jiǎn)稱限制酶來(lái)源：主要從原核細(xì)胞中分離作用結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端cult星同）GGGCCC-t平末端黏性末端思考1:若想獲得一個(gè)特定性狀的基因，必需要用限制酶切幾個(gè)切口？產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端把兩種來(lái)源不同的DNA用一種限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端會(huì)怎樣呢?2、DNA連接酶一一針線定義：能將限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)特點(diǎn)：無(wú)特異性TIrATAAtTA+T3、運(yùn)載體種類：原核生物的質(zhì)粒，噬菌體，動(dòng)植物病毒運(yùn)載體必須具備以下條件：DNA分子

2、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存具有多個(gè)限制酶切位點(diǎn)，以便與外源基因連接具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選，如抗性基因等具有復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)子常用的運(yùn)載體一一質(zhì)粒：小型雙鏈環(huán)狀DNA分子二、基因工程流程獲取目的基因通常有以下幾種方法獲取目的基因：從細(xì)胞中直接分離人工合成：反（逆）轉(zhuǎn)錄法；根據(jù)已知氨基酸序列合成相應(yīng)DNA目的基因與運(yùn)載體重組用相應(yīng)的限制酶切割目的基因及載體，將具有相同末端的目的基因和載體用DNA連接酶連在一起，形成重組DNA分子思考2：向用同一種限制酶處理后的目的基因和質(zhì)?；旌衔镏屑尤隓NA連接酶，最終得到的重組DNA分子有幾種？請(qǐng)用圖示表示細(xì)胞核限制繭J巫組質(zhì)粒質(zhì)粒導(dǎo)人受體細(xì)胞貂繭質(zhì)

3、粒捉取DNADNA聒選細(xì)盹增殖井表達(dá)產(chǎn)物導(dǎo)入受體細(xì)胞將重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的受體細(xì)胞有：大腸桿菌，枯草桿菌，土壤農(nóng)桿菌，酵母菌等方法：導(dǎo)入植物細(xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用的是花粉管通道法）；導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射技術(shù)（注射入受精卵中）；導(dǎo)入原核生物：一般是將細(xì)菌用氯化鈣處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。篩選含目的基因的受體細(xì)胞三、限制酶的選擇首先所選用的酶在目的基因和質(zhì)粒上都有酶切位點(diǎn)，一看目的基因：目的基因要切完整二看質(zhì)粒：要保留至少一個(gè)標(biāo)記基因復(fù)制起點(diǎn)和啟動(dòng)子（如果圖上有）不能切所切位置必需在復(fù)制起點(diǎn)與終點(diǎn)或者啟動(dòng)子與終止子之間三看重組子：有些題

4、目要求目的基因要與質(zhì)粒高效連接例1、（2019年松江一模）生物技術(shù)及生命科學(xué)的應(yīng)用。（13分）掘特VEeaarttliuJinftfllF表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。Ztaarlll蜃1切測(cè)竝點(diǎn)CCT4屮,GATGAACTHGT如TCCTACfTTCGAjAftindl1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)中通常用圖1中質(zhì)粒作為載體，質(zhì)粒的本質(zhì)。2、用圖1中質(zhì)粒和圖2目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過酶作用后獲得重組質(zhì)粒。3、若BamHI酶切的DNA末端與BelI酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為例2、（2019年

5、靜安一模）生物工程（12分）研究發(fā)現(xiàn)，利用抗體抑制腫瘤細(xì)胞表面的CD47蛋白的活性，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞。為制備抗CD47抗體，研究人員先利用基因工程方式制備CD47蛋白，圖5為含CD47基因的外源DNA、質(zhì)粒DNA的有關(guān)信息，EcoRI、BamHI、SalI、XhoI均為限制酶，Kanr、Ter分別為卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因。皿nI畑】XhttlBttrnH1（2分）為了形成合適的重組質(zhì)粒，應(yīng)該選用限制酶切割外源DNA和質(zhì)粒DNA。A.EcoRI和XhoIB.BamHI和XhoIC.EcoRI和SalID.BamHI和SalI例3、（2019青浦一模）回答有關(guān)基因工程與微生物的

6、問題。（12分）利用微生物分解廢紙是一種環(huán)保的方式，但廢紙中的纖維素分子量大不能直接進(jìn)入酵母菌，且酵母菌無(wú)法分解利用環(huán)境中的纖維素。為解決這一難題，科學(xué)家將纖維素酶基因通過重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌。其所用質(zhì)粒及其酶切位點(diǎn)如圖16,外源DNA上的纖維素酶基因及其酶切位點(diǎn)如圖17。BarH1險(xiǎn)【mm川纖堆盍梅堆因.oriA圖17（2分）圖17中的纖維素酶基因作為，質(zhì)粒作為。（2分）為使纖維素酶基因能夠與質(zhì)粒有效組合，應(yīng)選用最合適的限制酶A.BamHI和PstIB.HindIII和PstIC.PstID.BamHI和HindIII（2分）若質(zhì)粒被Hindlll限制酶識(shí)別的序列是-AAGCTT-,并在A與A

7、之間切割。請(qǐng)畫出被切割后所形成的黏性末端。例4、（2019年崇明一模）（2分）基因編輯技術(shù)所使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要對(duì)特定的DNA序列識(shí)別并切割，其功能類似于基因工程工具酶中的。例5、（2019年金山一模）生物技術(shù)及生命科學(xué)應(yīng)用（10分）嚴(yán)重聯(lián)合性免疫缺陷癥是一種T淋巴細(xì)胞缺乏腺苷脫氨酶（ADA）引起的疾病，通過基因工程的方法將正常ADA基因?qū)牖颊呒?xì)胞中進(jìn)行治療。圖17分別表示正常ADA基因、金屬硫蛋白基因（含有該基因的細(xì)胞能在含重金屬鎘的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)）和質(zhì)粒（總長(zhǎng)為3.8kb,1kb=1000對(duì)堿基），ClaI、XbaI和SacI均為限制酶。Clt正常ADA基因SkI畑套屈碓蛋

8、白基因Clai5aIB.4khxkl禺I?（2分）為了篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，需要先將目的基因和標(biāo)記基因連接形成融合基因。首先用限制酶切割正常腺苷脫氨酶基因與金屬硫蛋白基因，然后用DNA連接酶將它們連接形成融合基因。（2分）將上述融合基因與圖17中的質(zhì)粒構(gòu)建成重組質(zhì)粒時(shí)，應(yīng)選用的限制酶D.ClaI和SacIA.ClaIB.SacI和XbaIC.ClaI和XbaI抗竹:虞因窗執(zhí)性基因例6、（2019年長(zhǎng)寧一模）圖17示基因J所在的DNA片段，圖18示質(zhì)粒的部分堿基序列。（現(xiàn)有4種限制酶：MspI、BamHI、MboI、EcoRI,能識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為CICGG、GIGATCGIG

9、ATC、GIAATTC）。目的基因J1111111i,iit111111111111GGATCCCCCGGGGGATCCCCTAGGGGGCCCCCTAGGlUlTDhJ-lIUlLLL1.（2分）據(jù)圖17、18分析，過程（形成重組DNA分子）中不能（宜）使用的限制酶有（多選）。A.MspIB.BamHIC.MboID.EcoRI例7、（2018年寶山二模）回答下列關(guān)于遺傳信息的表達(dá)和生物工程問題（12分）IPslInindI圖L4圖11為限制酶EcoRI的識(shí)別序列，圖12表示質(zhì)粒，圖13表示目的基因上的DNA片段，圖14表示目的基因及限制酶切點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問題：EKIIGAATTCCTTAA

10、f；圖11圖11中限制酶EcoRI的特點(diǎn)是o（2分）為了使目的基因和質(zhì)粒定向連接并且有利于受體細(xì)胞的篩選，提高重組效率，應(yīng)該選擇的限制酶是課堂作業(yè)1、（2018年奉賢二模）回答下列有關(guān)轉(zhuǎn)基因技術(shù)問題（12分）冃的基國(guó)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將綠色熒光蛋白基因（G）整合到斑馬魚17號(hào)染色體上，帶有G基因的胚胎能夠發(fā)出綠色熒光。圖14和圖15所示分別為實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒上相關(guān)酶切位點(diǎn)以及含綠色熒光蛋白基因（G）的外源DNA片段上具有的相關(guān)酶切位點(diǎn)。含G基園的蚪測(cè)DMA片段圖15SmoIHind111（1）基于上述信息，該基因工程的目的基因。（2）用圖14中的質(zhì)粒和圖15外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用切割，原因

11、是。如果要防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，則應(yīng)選擇下列方法（填編號(hào)）為好。只使用EcoRI處理使用BamHI和SmaI同時(shí)處理使用BamHI和HindIII使用SmaI和HindIII同時(shí)處理2、（2018年虹口二模）回答有關(guān)現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用的問題（10分）。乳糖不耐受是由于乳糖酶（LCT）分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹瀉。我國(guó)利用生物技術(shù)培育出轉(zhuǎn)基因低乳糖奶牛新品種，給患乳糖不耐癥患者帶來(lái)福音。圖18為轉(zhuǎn)基因低乳糖奶牛培育流程。圖19是使用限制酶BamHI切開DNA產(chǎn)生的結(jié)果。BmirHI阮彌I牛WLAH18反屮尺轉(zhuǎn)顯因氈乳-TACjGATCCTC

12、GATC-BawH1TAGGATCCTCGATC-“ATCCTAGGAGC1XG八f-ATCCTACjGAGCTAG-圖19（1）（2分）據(jù)圖19分析，BamHI的識(shí)別序列以及切割位點(diǎn)（用“廠表示）3、（2018年黃埔二模）生物技術(shù)及生命科學(xué)的應(yīng)用（12分）。普通番茄細(xì)胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制細(xì)胞產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶，該酶能破壞細(xì)胞壁，使番茄軟化，不耐貯藏?？茖W(xué)家將抗多聚半乳糖醛酸酶基因?qū)敕鸭?xì)胞，培育出了抗軟化、保鮮時(shí)間長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因番茄。目的基因和質(zhì)粒（含卡那霉素抗性基因KmR）上有Pstl、Smal、Hindlll、Alul四種限制酶切割位點(diǎn)。操作流程如圖16所示。（1）（2分）本實(shí)驗(yàn)中的目的基因是。（2）（2分）在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用一種或者多種限制酶進(jìn)行切割。為了確保目的基因與載體進(jìn)行高效拼接，在此實(shí)例中，應(yīng)該選用限制酶是（多選）。A.PstlB.SmalC.AlulD.Hindlll答案：思考2如下圖*枷相莊佝+陸農(nóng)沛*跆柚曬必腳內(nèi)例1：(1)小型雙鏈閉環(huán)的DNA分子(2)Bell和HindIII(2分)DNA連接TGATCCACTMGCGATCA(3)CCTAGT例2：(1)B例3：(1)目的基因運(yùn)載體(每空1分，共2分)(2)B(2分)-AAGCT7-AII.-._例4：限制酶例5