高考生物專題生物技術(shù)實踐第37講DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)選修1

1、高考生物專題生物技術(shù)實踐第 37 講DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)選修11進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定。2嘗試PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。3嘗試蛋白質(zhì)的提取和分離。1(2010江蘇)某生物興趣小組開展DNA粗提取的相關(guān)探究活動。具體步驟如下：材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份，每份10 g。剪碎后分成兩組，一組置于20 、另一組置于20 條件下保存24 h。DNA粗提?。旱谝徊剑簩⑸鲜霾牧戏謩e放入研缽中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過濾，取濾液備用。第二步：先向6只小燒杯中分別注入10 mL濾液，再加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒緩緩地向一個方向攪拌，使絮狀物纏

2、繞在玻璃棒上。第三步：取6支試管，分別加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮狀物。DNA檢測：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑，混合均勻后，置于沸水中加熱5 min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺，結(jié)果如下表。(注：“”越多表示藍(lán)色越深)分析上述實驗過程，回答下列問題：(1)該探究性實驗課題名稱是 。(2)第二步中“緩緩地”攪拌，這是為了減少 。 探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響DNA斷裂(3)根據(jù)實驗結(jié)果，得出結(jié)論并分析。結(jié)論1：與20 相比，相同實驗材料在20 條件下保存，DNA的提取量較多。 結(jié)論2： 。針對結(jié)論1，請?zhí)岢龊侠淼慕忉專?。(4)氯仿密度大于水，

3、能使蛋白質(zhì)變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對DNA影響極小。為了進(jìn)一步提高DNA純度，依據(jù)氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基礎(chǔ)上繼續(xù)操作的步驟是： ，然后用體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液使DNA析出。 等質(zhì)量的不同實驗材料，在相同的保存溫度下，從蒜黃提取的DNA量最多 低溫抑制了相關(guān)酶的活性，DNA降解速度慢 將第三步獲得的溶液分別與等量的氯仿充分混合，靜置一段時間，吸取上清液 本題考查了DNA粗提取技術(shù)的原理、操作過程及學(xué)生的分析、判斷能力。從題目實驗看出，該實驗的課題名稱是探究不同材料和不同保存溫度對DNA提取量的影響。在實驗的第二步中，為了防止DNA斷裂，要緩緩地攪拌。從表中結(jié)果看出，

4、由于低溫抑制了相關(guān)酶的活性，DNA降解慢，使得相同材料在低溫保存時，DNA提取量大；在相同保存條件下，蒜黃藍(lán)色最深，說明相同條件下從蒜黃中提取的DNA量最大。由于氯仿密度比水大，可使蛋白質(zhì)變性后沉淀，而與水、DNA不相溶，這樣可將第三步獲得的溶液分別與等量的氯仿混合，靜置一段時間，吸取上清液即可得到較純凈的DNA。 2.(2008山東)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)家蠅體內(nèi)存在一種抗菌活性蛋白。這種蛋白質(zhì)具有極強的抗菌能力，受到研究者重視。(1)分離該抗菌蛋白可用電泳法，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的，大小及性狀不同，在電場中的不同而實現(xiàn)分離。電荷(帶電情況)遷移速度(2)可用金黃色葡萄球菌來檢驗該蛋白質(zhì)的體外抗菌特性

5、?？咕鷮嶒炈门囵B(yǎng)基中的牛肉膏和蛋白胨主要為細(xì)菌生長提供和。(3)分別在加入和未加入該抗菌蛋白的培養(yǎng)基中接種等量菌液。培養(yǎng)一定時間后，比較兩種培養(yǎng)基中菌落的，確定該蛋白質(zhì)的抗菌效果。(4)抗菌培養(yǎng)常用的接種方法有 .和。實驗結(jié)束后，對使用過的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行處理。碳源氮源數(shù)量平板劃線法稀釋涂布平板法(稀釋混合平板法)滅菌(1)電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負(fù)電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以

6、及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。(2)牛肉膏和蛋白胨是成分復(fù)雜的天然有機(jī)物，能為微生物提供碳源、氮源。(3)可采用逆向思維。若抗菌蛋白具有抗菌效果，即抗菌蛋白抑制了金黃色葡萄球菌的生長繁殖，則不形成菌落或菌落數(shù)量明顯偏少。(4)微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋。然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。實驗結(jié)束后，使用過的培養(yǎng)基應(yīng)該進(jìn)

7、行滅菌處理才能倒掉，這樣做的目的是防止造成環(huán)境污染。一、DNA的粗提取與鑒定1.原理粗提取DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。在0.14 mol/L 的NaCl溶液中DNA溶解度最 .DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精DNA與雜質(zhì)對酶、高溫和洗滌劑的耐受性不同鑒定DNA+藍(lán)色二苯胺沸水浴5 min低2.粗提取流程(以雞血細(xì)胞液做實驗材料為例)3.鑒定序號試管A試管B2 mol/L 的NaCl溶液5 mL5 mL加絲狀物，用玻璃棒攪拌加二苯胺4 mL ，混勻4 mL ，混勻沸水浴5 min5 min實驗現(xiàn)象變藍(lán)不變藍(lán)實驗結(jié)論絲狀物的主要成分是DNA分子

8、本實驗不能用哺乳動物的成熟紅細(xì)胞作實驗材料，原因是哺乳動物的成熟紅細(xì)胞內(nèi)無細(xì)胞核，但它可作為血紅蛋白提取和制備細(xì)胞膜的理想材料。體內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供能量，部分解開加熱至90 ，雙鏈全部解開，不需解旋酶溫度體內(nèi)溫和條件高溫引物一小段RNARNA或單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度72 二、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1.生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的比較體內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)特點邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制體外迅速擴(kuò)增酶解旋酶、DNA聚合酶等TaqDNA聚合酶循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多

9、次相同點生物體內(nèi)的DNA復(fù)制和PCR體外DNA擴(kuò)增都需要模板、四種脫氧核苷酸，子鏈延伸的方向都是從5端3端條件穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境；DNA模板；分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；A、T、G、C四種脫氧核苷酸；耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；能嚴(yán)格控制溫度變化的溫控設(shè)備過程變性：當(dāng)溫度上升到90 以上時，雙鏈DNA解旋為單鏈復(fù)性：溫度下降為50 左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸：當(dāng)溫度上升到72 左右，四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈反應(yīng)蛋白質(zhì)分離的方法三、血紅蛋白的提取和分離1.蛋白質(zhì)分離的方法凝膠色譜法電泳

10、法蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大相對分子質(zhì)量小運動方式排阻在凝膠顆粒外面，迅速通過進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，被滯留移動速度.運動路程較短較長洗脫次序先后凝膠色譜法較快較慢原理:一些生物大分子(如多肽、核酸等),在一定pH下，其可解離的基團(tuán)會帶上正電或負(fù)電,在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷的電極移動影響因素:各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀常用方法:瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳(通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳)電泳法相反SDS步驟目的過程樣品處理紅細(xì)胞洗滌去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化分離(低速短時間離心)用膠頭吸管吸去上層透明黃色血漿下層紅色細(xì)胞用洗滌(低速短時間離心)三次血

11、紅蛋白的釋放使紅細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白依圖中abcd順序2.蛋白質(zhì)的提取和分離操作流程生理鹽水步驟目的過程樣品處理分離血紅蛋白經(jīng)過離心使血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開來，便于下一步對血紅蛋白的純化攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移至離心管中，2000 r/min速度離心10 min(高速長時間)濾紙過濾除去雜質(zhì)得血紅蛋白粗分離(透析)除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品的緩沖液1 mL 血紅蛋白溶液透析袋20 mmol/L 的 (pH為7.0) 12h裝入放入透析磷酸緩沖液步驟目的過程純化凝膠色譜柱制作通過凝膠色譜操作，根據(jù) . .分離蛋白質(zhì)(將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去)取玻璃管制作柱底部制作柱頂部凝膠色譜柱

12、的裝填固定色譜柱計算所需凝膠量凝膠用蒸餾水溶脹裝填洗滌平衡樣品的加入和洗脫調(diào)整緩沖液面滴加透析樣品樣品滲入凝膠床洗脫收集相對分子質(zhì)量的大小步驟目的過程純度鑒定判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(操作選做) 相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量較小的容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，而相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)只能在凝膠外部移動，移動速度快，因此相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子彼此分離。1.如何正確區(qū)分破碎動物細(xì)胞和植物細(xì)胞的原理和方法？原理方法動物細(xì)胞(雞血細(xì)胞)在低濃度溶液中會吸水甚至漲破雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液植物細(xì)胞(洋蔥

13、細(xì)胞)洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜在切碎的洋蔥中，加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液2.教材中去除濾液中雜質(zhì)的三種方案有什么不同？原理方法方案一DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同在濾液中加入2 mol/L NaCl溶液，過濾除去不溶雜質(zhì)；再調(diào)節(jié)NaCl溶液濃度為0.14 mol/L ，析出DNA，過濾除去不溶的雜質(zhì)，再用2 mol/L NaCl溶液溶解DNA原理方法方案二DNA對酶的耐受性直接在濾液中加入嫩肉粉，反應(yīng)1015 min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)方案三DNA對高溫的耐受性將濾液放在6075 的恒溫水浴箱中保溫1015 min，注意嚴(yán)格控制溫度范

14、圍，使蛋白質(zhì)沉淀而DNA分子還未變性，可將DNA與蛋白質(zhì)分離3.如何區(qū)分DNA粗提取實驗中部分操作的目的？加蒸餾水加到雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞吸水脹裂加到含DNA的2 mol/L NaCl溶液，使DNA析出用紗布過濾過濾血細(xì)胞破裂液，提取細(xì)胞核物質(zhì)(濾液)濾取0.14 mol/L NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)過濾溶有DNA的2 mol/L NaCl溶液(濾液)用NaCl溶液加2 mol/L NaCl溶液，溶解提取的細(xì)胞核物質(zhì)(加蒸餾水)0.14 mol/L NaCl溶液使DNA析出加2 mol/L NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物用2 mol/L NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA

15、4.什么是3端和5端？DNA復(fù)制為什么需要引物？ 為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(OH)末端稱為3端，而含磷酸基團(tuán)的末端稱為5端；一個雙鏈DNA分子中含2個3端和2個5端，如果一條鏈的方向是35，則另一條鏈的方向就是53，這就是反向平行的含意。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈。PCR實驗中，引物長度通常為2030個核苷酸。實驗中應(yīng)注意哪些問題？如何進(jìn)行PCR結(jié)果的分析與評價？ (1)PCR實驗中的注意事項：避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前進(jìn)行高壓滅菌。緩沖液和酶分裝成小份，-20 低溫保存。每添加一種反應(yīng)成分，更換一個移液器的槍頭

16、。混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。(2)PCR結(jié)果的分析與評價：對于教材中的方法，可以通過計算DNA含量來評價擴(kuò)增的效果。原理：DNA在260 nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。過程：稀釋對照調(diào)零測定計算。對于電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的效果。擴(kuò)增不成功的可能原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?.分離血紅蛋白的樣品處理中，紅細(xì)胞洗滌時為什么要低速短時間離心，并且要洗滌三次？ 紅細(xì)胞洗滌時，洗滌次數(shù)、離心速度與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白；離心速

17、度過高和時間過長會使白細(xì)胞等一起沉淀，達(dá)不到分離的效果。洗滌三次后，若上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無法除去血漿蛋白。7.凝膠色譜柱的裝填有什么要求？如何進(jìn)行樣品的加入和洗脫？ 在色譜柱中填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時，不能有氣泡存在，因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，不要破壞凝膠面。在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜

18、柱制作成功。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動狀況判斷收集流出液時間，待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5 mL 收集一管，連續(xù)收集。DNA的粗提取與鑒定 下表是關(guān)于DNA粗提取與鑒定實驗中，所使用的材料、操作及其作用的表述，正確的是()試劑操作作用A檸檬酸鈉溶液與雞血混合防止DNA受損B蒸餾水與雞血細(xì)胞混合保持細(xì)胞形狀C蒸餾水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中析出DNA絲狀物D冷卻的酒精加入到過濾后含DNA的NaCl溶液中產(chǎn)生特定的顏色反應(yīng) C在“DNA粗提取與鑒定”實驗中檸檬酸鈉可以防止血液凝固；雞血中加入蒸餾水可以使細(xì)胞膜破裂；DNA在不同的氯化鈉溶液中的溶解度不同，在0.14 mol

19、/L 時，溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)可以溶于酒精，所以加入酒精，可以獲得較純的DNA；DNA遇二苯胺產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)(需要沸水浴加熱)。在“DNA粗提取與鑒定”的實驗中，將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2 mL 的四種溶液中，經(jīng)攪拌后過濾，獲得4種濾液，含DNA較少的是()A.B.C.D.C1蒸餾水中攪拌后過濾濾液E22 mol/L 的NaCl溶液攪拌后過濾濾液F30.14 mol/L 的NaCl溶液中攪拌后過濾濾液G4冷卻的95%的酒精溶液中攪拌后過濾濾液HDNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L 的NaCl溶液中溶解度

20、最低，參照DNA在NaCl溶液中溶解度曲線，可知中只有濾液G中DNA含量較少。DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精，利用這一原理可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離，可見濾液H中DNA也較少。DNA與蛋白質(zhì)的溶解性不同：溶解規(guī)律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白質(zhì)NaCl溶液濃度從2 mol/L降低過程中，其溶解度逐漸增大部分發(fā)生鹽析沉淀溶解多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 關(guān)于DNA的復(fù)制，下列敘述正確的是()聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5端延伸DNA鏈復(fù)制不需要引物C.引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進(jìn)行結(jié)合的合成方向總是從子鏈的3端向5

21、端延伸 C由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3端即復(fù)制方向由3端向5端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補配對原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈5端向3端延伸。下圖示PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取DNA的過程。擴(kuò)增時首先使DNA兩條鏈解開為單鏈；然后冷卻使“引物”(DNA復(fù)制時所需的約20個核苷酸的短鏈)與單鏈相應(yīng)堿基互補序列結(jié)合；再在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，合成與模板互補的DNA新鏈，如此反復(fù)循環(huán)。上述過程可在PCR擴(kuò)增儀中自動完成。(1)圖中過程也稱為DNA的變性，此過程在溫度高達(dá)9095 時才能完成，說明DNA分子具有性。(2)過程在人體內(nèi)可由.催化完成。(3)由題中信息可知，在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行DNA自動擴(kuò)增時，若起始時有a個DNA分子，連續(xù)擴(kuò)增n代，可形成個DN