瓊脂糖凝膠電泳

1、一、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入 到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)(瓊脂糖凝膠)的樣品孔中，并置于靜電場(chǎng)上。 由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場(chǎng)中向正 極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。具有不 同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來(lái)使 其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量 相同，而構(gòu)型不同的DNA分子。在電泳過(guò)程中可以通過(guò)示蹤染料或相對(duì)分子質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對(duì)可以 提供一

2、個(gè)用于確定DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。在凝膠中加入少量漠化乙錠(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254365nm 波長(zhǎng)紫外光照射下，呈桔紅色熒光，因此也可對(duì)分離的DNA進(jìn)行檢測(cè)。一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在0.2kb50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)介紹 瓊脂糖凝膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在DNA片段分離中的應(yīng)用方法。二、儀器及試劑儀器及耗材：水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點(diǎn) 樣板或parafilm、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。試劑及配制：50XTAE 緩沖液的配制：2 mol/L

3、 Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA (pH 8.0) 配制1000 ml Tris 242 g 冰乙酸57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫 保存。1XTAE緩沖液的配制：稱(chēng)量20 ml的50XTAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。漠化乙啶貯存液：10 mg/ml漠化乙啶配制：100 ml稱(chēng)取1 g漠化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將 溶液定容至100 ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。6X上樣緩沖液：0.25%漠酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30

4、%甘油。配制：10 ml漠酚藍(lán)25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6XTAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20C保存。其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟制備1%瓊脂糖凝膠（大膠用70ml，小膠用50ml）:稱(chēng)取0.7 g（0.5 g）瓊脂 糖置于錐形瓶中，加入70 ml （50ml） 1XTAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮 沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠 玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平 位置，并在固定位

5、置放好梳子。將冷卻到65C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地 倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開(kāi)，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫 下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽 中。添加1XTAE電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板為止。加樣：在點(diǎn)樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最 終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽 內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周?chē)?的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60-100V，樣品由負(fù)極（黑 色）向正極

6、（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng) 漠酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的漠化乙錠1 XTAE溶液染色約20 min，再用清水漂洗10 min。觀(guān)察照相：在紫外燈下觀(guān)察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。四、常見(jiàn)問(wèn)題及注意事項(xiàng)配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時(shí)要輕緩。電泳時(shí)應(yīng)注意電源線(xiàn)路，預(yù)防觸電。漠化乙淀具有致癌作用，配制及使用時(shí)應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專(zhuān) 門(mén)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。紫外線(xiàn)對(duì)人體有損傷作用，開(kāi)燈時(shí)間不宜太長(zhǎng)，注意防護(hù)。DNA帶形狀模糊：DNA加

7、樣過(guò)多；電壓太高；凝膠中有氣泡。質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，共價(jià)閉環(huán)DNA （cccDNA），常以超螺旋形式存 在；開(kāi)環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂， 因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；線(xiàn)狀DNA，因質(zhì)粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶， 它們的泳動(dòng)速度為：cccDNA 線(xiàn)狀DNA ocDNA。1.瓊脂糖凝膠電泳的準(zhǔn)備和操作方法1.1制備瓊脂糖凝膠是應(yīng)注意避免氣泡用緩沖液配制所需濃度的瓊脂糖凝膠，水浴或微波爐中加熱使瓊脂糖完全 融化，將溶液冷至55 C，用少量瓊脂糖凝膠將玻璃板或有機(jī)玻璃板

8、封邊，放 置樣品梳（梳齒下端離玻璃板0.5 -1.0mm ）。接著將融化的瓊脂糖凝膠溶液不 間斷地倒在玻璃板上或有機(jī)玻璃板模子中（厚度依樣品濃度而定，須注意避免氣 泡混入），室溫下自然凝固。待完全凝固后小心取出加樣器，在電泳槽中加入 適量電泳緩沖液，使膠板浸沒(méi)在電泳緩沖液下約1mm處。1.2樣品制備與加樣所加樣品應(yīng)有適當(dāng)濃度與較小體積，用微量注射器緩慢加入樣品，點(diǎn)樣時(shí)電 源必須處于關(guān)閉狀態(tài)。為了指示電泳的距離，避免樣品在電泳槽緩沖液中飄浮， 常在制備好的樣品中加入含有蔗糖或甘油以及指示劑（漠酚藍(lán)、二甲苯青等）的 上樣緩沖液。另外，樣品中含鹽量不能太高，否則電泳中會(huì)出現(xiàn)區(qū)帶消失、前沿 不齊等現(xiàn)象

9、。樣品中DNA含量以每條區(qū)帶的DNA不少于0.1 u g為宜，DNA濃 度過(guò)高會(huì)使電泳區(qū)帶變寬，泳動(dòng)距離異常。樣品的用量由加樣孔的體積決定，通常為10-50 u g。1.3電泳電泳溫度視需要而定。對(duì)于大分子的分離，宜低溫，電壓應(yīng)低（一般不超過(guò) 5V/cm ）。普通電泳可在室溫進(jìn)行，電泳的電壓為5-15V/cm。1.4染色一以DNA電泳為例常用熒光染料漠化乙錠（EB ）進(jìn)行染色以觀(guān)察在瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。EB能插入DNA分子中堿基對(duì)之間，使EB與DNA結(jié)合（超螺旋DNA與EB結(jié)合 能力小于雙鏈閉環(huán)，而雙鏈閉環(huán)的DNA與EB結(jié)合能力小于線(xiàn)狀雙鏈DNA ）。將 以染色的凝膠浸泡在1mmol/l

10、MgSO 4溶液中1小時(shí)，可以降低未結(jié)合的EB所 引起的背景熒光，以提高檢測(cè)的靈敏度。EB染料有很多優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便多余的EB不干擾紫外線(xiàn)燈下的檢測(cè)（因?yàn)橹挥薪Y(jié)合了核酸的EB才能顯示熒光） 不會(huì)使核酸斷裂（其他染料不易做到這一點(diǎn)）靈敏度高，且對(duì)DNA或RNA均可顯色EB可以加到樣品中，并可隨時(shí)用紫外線(xiàn)吸收追蹤檢查，染色之后還可用正丁醇 提取除去EB但必須注意，EB染料具有潛在的致癌性，應(yīng)避免直接接觸，使用時(shí)必須帶手套。1.5樣品回收常用有下列方法電泳結(jié)束后在紫外線(xiàn)下觀(guān)察樣品的分離情況，對(duì)需要的DNA 分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同方法進(jìn)行回收。(1)電泳完畢后，于紫外線(xiàn)下切下需回收的DN

11、A區(qū)帶，將凝膠條置于含有適量 緩沖液的透析袋中，再放入電泳槽電泳30-60分鐘，使DNA分子泳動(dòng) 透析袋電洗脫法一本法適用于分子量較小的DNA片段的回收。到透析袋靠正極一側(cè)的壁上，然后反向電泳30-60秒，使貼在透析模上的DNA分 子泳動(dòng)到袋PH為8.0的緩沖液中。吸出袋內(nèi)的緩沖液并用正丁醇抽提或乙醇沉 淀所需的DNA分子。(2)采用低融點(diǎn)瓊脂糖制備的電泳凝膠，電泳完畢后可在紫外燈下切下擬回收的 DNA區(qū)帶，于65 C保溫10-20分鐘。膠條融化后，再用酚-氯仿抽提，最后 用95%的冷乙醇沉淀抽提DNA片段，此法回收率可達(dá)80%。優(yōu)點(diǎn)是可直接在融 化的凝膠中進(jìn)行各種酶反應(yīng)。但操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制融

12、膠和電泳溫度。 低融點(diǎn)瓊脂糖法(3)用瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分離后，于紫外燈下在緊靠待回收DNA片段 前方切一裂隙，將條狀DEAE纖維素膜插入裂隙中，繼續(xù)電泳直至帶中所有的DNA 均轉(zhuǎn)移至膜上。再用低粒子強(qiáng)度的緩沖液洗掉膜中雜質(zhì)，然后在高離子強(qiáng)度的緩 沖液中將DNA洗脫下來(lái)，最后用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀DNA分子。本法回收 的DNA純度很高。DEAE纖維素膜法一本法適宜小于5kb的雙鏈DNA分子的回收此外，還有醋酸銨溶液浸出法、冷凍擠壓法等。目前瓊脂糖凝膠電泳樣品回收存在的問(wèn)題主要有以下幾方面：絕大多數(shù)的瓊脂糖混雜有硫酸鹽多糖，它能與DNA 一起從凝膠中被抽提 出來(lái)，這些物質(zhì)是許多酶的強(qiáng)抑

13、制物；可將回收的DNA沉淀數(shù)次或采用超純瓊 脂糖的方法解決這一問(wèn)題。從瓊脂糖凝膠抽提出DNA的效率與其分子量有關(guān)。瓊脂糖凝膠電泳可以十 分有效地回收小于1kb長(zhǎng)度的DNA片段。隨著DNA分子量增大，回收量則顯著 降低，片段大于20kb時(shí)，回收率很難超過(guò)20%。三、在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用瓊脂糖 凝膠電泳是分離、鑒定、純化DNA片段的主要方法，目前主要用于重組基因的 分離、鑒定、限制性酶切圖譜分析、Southern、Northern、Western雜交分析， 以及PCR產(chǎn)物的分離鑒定等。測(cè)定CK和CK-MB是目前用于證實(shí)心肌損傷和心 肌梗死早期診斷的指標(biāo)之一。使用免疫抑制法測(cè)定CK-MB易受CK-BB和異

14、常CK 的干擾，導(dǎo)致CK-MB測(cè)定假性升高。采用瓊脂糖凝膠電泳可分離出三種CK同功酶，分別為 CK-MM、CK-MB、CK-BB。當(dāng)出現(xiàn)異常同功酶如巨分子CK時(shí)，在電泳圖譜上很 易被發(fā)現(xiàn)，從而避免誤診。血清經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用膽固醇基質(zhì)試劑均勻鋪 在凝膠表面，孵育一段時(shí)間，即可見(jiàn)清晰的藍(lán)色條帶，依次是高密度脂蛋白膽固 醇、快前B脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。凝膠 片用冰醋酸固定、水洗、烤干后，570nm波長(zhǎng)掃描，即可確定各組分的百分率 含量。根據(jù)血清總膽固醇值可求得這四種脂蛋白膽固醇值。瓊脂糖是從瓊脂中分離制備的鏈狀多糖，其結(jié)構(gòu)單元是D半乳糖3，6-脫水-L半乳糖。

15、許多瓊脂糖分子依靠氫鍵及其他力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊 脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。該物質(zhì)對(duì)尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強(qiáng)的 抵抗力。在PH4.0 - 9.0的緩沖液中是穩(wěn)定的。由于其分子上無(wú)帶電基團(tuán)，在 緩沖液離子強(qiáng)度大于0.05時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)吸附作用，也無(wú)電滲現(xiàn)象，因而分辨 率和重現(xiàn)性均較好，是一種優(yōu)良的電泳材料。在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中， 如DNA分子的電泳遷移率與其分子量、分子構(gòu)型和所用緩沖液對(duì)遷移率相關(guān)。 當(dāng)凝膠濃度太高時(shí)，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA （球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷 移率為零，而同等大小的直線(xiàn)DNA （剛性棒狀）可以按長(zhǎng)軸方向前移，相對(duì)遷 移率大于零。脂蛋白可在

16、不同的支持介質(zhì)中進(jìn)行電泳分離，但最常用的是瓊脂糖 電泳。電泳后用脂溶性染料使脂質(zhì)部分著色，用光密度計(jì)掃描得出各部分脂蛋白 的相對(duì)比例。異常脂蛋白血癥分型時(shí)應(yīng)參考血脂及載脂蛋白測(cè)定結(jié)果。源自百度百科原理瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理 與其他支持物電泳的最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩和“電泳的雙重 作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì) 在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于 凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。 但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣 泛應(yīng)用于

17、核酸的研究中。蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)PH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同， 因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開(kāi)。電泳緩沖液的PH在69之間，離子強(qiáng)度0.020.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂 糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低， 但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb， 利用脈沖電泳，可分離高達(dá)10”7bp的DNA片段。操作流程準(zhǔn)備干凈的配膠板和電泳槽注意DNA酶污染的儀器可能會(huì)降解DNA，造成條帶信號(hào)弱、模糊甚至缺 失的現(xiàn)象。1、選擇電泳方法一般的核酸檢測(cè)只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨

18、率高的 電泳，特別是只有幾個(gè)bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通 電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。2、正確選擇凝膠濃度對(duì)于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在 0.52%之間，低濃度的用來(lái)進(jìn)行 大片段核酸的電泳，高濃度的用來(lái)進(jìn)行小片段分析。低濃度膠易碎，小心 操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小 相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。3、適合的電泳緩沖液常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳 時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后， 離子強(qiáng)度

19、降低，PH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊 和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。4、電泳的合適電壓和溫度電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過(guò)20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30C，對(duì)于巨大的 DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15C。注意如果電泳時(shí)電壓和溫度過(guò)高，可能導(dǎo) 致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致 小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象5、DNA樣品的純度和狀態(tài)是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象DNA樣品的純度和 狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失 的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要