1化學(xué)鍵合相色法課件

1、第九章1化學(xué)鍵合相色譜主要內(nèi)容概述：特點(diǎn) 一固定相的制備和性能評(píng)價(jià) 二非極性鍵合相三新型高效化學(xué)鍵合固定相四一、概 述1、化學(xué)鍵合相色譜的定義2、化學(xué)鍵合相的特點(diǎn)3、化學(xué)鍵合相的穩(wěn)定性3、化學(xué)鍵合相的分類1、化學(xué)鍵合相色譜的定義化學(xué)鍵合相色譜借助于化學(xué)反應(yīng)的方法將有機(jī)分子以共價(jià)鍵連接在色譜擔(dān)體上形成化學(xué)鍵合相，以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜（bonded phase chromatography，BPC），簡(jiǎn)稱鍵合相色譜。 2、化學(xué)鍵合相的特點(diǎn)與液液分配色譜相比，使用過(guò)程中固定相不流失，耐溶劑沖洗。與液固吸附色譜相比，消除了擔(dān)體上的表面活性作用點(diǎn)，清除了某些可能的催化活性。表面

2、改性靈活，容易獲得重復(fù)性產(chǎn)品?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，耐受范圍為pH28。熱穩(wěn)定性好，一般在70以下穩(wěn)定。載樣量大，比硅膠約高一個(gè)數(shù)量級(jí)。梯度洗脫平衡快。3、化學(xué)鍵合相的穩(wěn)定性1在較低pH值條件下（pH9） 鍵合相中SiOSi鍵很容易被KOH和NaOH這一類強(qiáng)堿性親核試劑所切斷： 4、化學(xué)鍵合相的分類 化學(xué)鍵合相的分類可以有不同的依據(jù)。按鍵合相的表面結(jié)構(gòu)：?jiǎn)畏肿渔I合和聚合鍵合；按鍵合有機(jī)硅烷的官能團(tuán)：極性鍵合相、非極性鍵和相和離子交換鍵合相三種。二、固定相1、化學(xué)鍵合相的制備2、常見(jiàn)的官能團(tuán)3、常用的鍵合相商品牌號(hào)4、化學(xué)鍵合相性能評(píng)價(jià)5、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題1、化學(xué)鍵合相的制備要形成化學(xué)鍵合固定

3、相，有兩個(gè)必要條件：所用的擔(dān)體材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性，如硅膠、氧化鋁、硅藻土等表面都具有化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)，一般以硅膠最為理想的和常用。有機(jī)分子應(yīng)含有能與擔(dān)體表面發(fā)生反應(yīng)的官能團(tuán)。硅膠（SiO2xH2O）之所以是理想的化學(xué)鍵合相擔(dān)體，主要由它的表面性質(zhì)所決定。硅膠具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、容易控制的孔結(jié)構(gòu)和比表面積、較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性以及專一的表面化學(xué)反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，另外，硅膠表面存在著足夠的可反應(yīng)硅羥基，因而是各種化學(xué)鍵合相理想基質(zhì)材料。硅膠的性質(zhì)1、化學(xué)鍵合相的制備硅膠預(yù)處理 溶劑與試劑預(yù)處理 衍生化反應(yīng) 端基封尾 (1)硅膠的預(yù)處理在制備鍵合相時(shí)，首先作為擔(dān)體的硅膠需要酸處理，洗去制備、運(yùn)

4、輸和保存過(guò)程中引入的污染物；除去表面層的金屬氧化物雜質(zhì)，如Na+、Ca2+、Al3+、Fe3+等；使表面的硅氧烷鍵打開(kāi)，形成盡可能多的自由羥基，有利于反應(yīng)。(1)硅膠的預(yù)處理酸處理酸處理可以用0.1 mol/L的鹽酸，于90下浸泡24 h，或以10%的鹽酸在回流狀態(tài)處理8 h 。中 和中和，水洗至無(wú)Cl- ，經(jīng)酸處理后的硅膠表面的羥基濃度已達(dá)到理論值8 mol/m2左右。 干 燥在200以下真空烘干除去物理吸附水，注意不得超過(guò)200，否則硅醇基脫水形成硅氧烷結(jié)構(gòu)。（2）溶劑與試劑預(yù)處理 硅烷化試劑對(duì)水很敏感，使用前應(yīng)以蒸餾方式進(jìn)行純化或以玻璃棉將其中的懸浮物濾去。所使用的有機(jī)溶劑，必須進(jìn)行干燥

5、。（3）衍生化反應(yīng) （1）SiOC鍵型（2）SiN或SiC鍵型 （3）SiOSiC鍵型 SiOC鍵型酯化反應(yīng)是最早用于制備化學(xué)鍵合相的反應(yīng)。這類固定相是直接用硅羥基SiOH與醇類ROH通過(guò)酯化反應(yīng)制得。酯化反應(yīng)在硅膠表面形成單分子層的硅酸酯。這類固定相雖然有很高的柱效，但是它顯著的缺點(diǎn)是易水解、醇解，熱穩(wěn)定性差，在色譜發(fā)展早期用于正相色譜模式中，現(xiàn)已不大使用。 SiN或SiC鍵型這類固定相比SiOC鍵型固定相的水解穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好，但適用pH值范圍窄（pH48），因此實(shí)用價(jià)值亦不大。 SiOSiC鍵型SiOSiC鍵型是一類目前占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的鍵合相類型，具有良好的熱穩(wěn)定性及化學(xué)穩(wěn)定性，能在pH

6、28的介質(zhì)中使用。這類鍵合固定相是硅膠上的硅羥基與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷試劑反應(yīng)而得。 單官能團(tuán)有機(jī)硅烷 X 通常為Cl、OH、OCH3、OC2H5等官能團(tuán)；R 通常為直鏈或支鏈烷基、芳香基，如CH3、C4H9、C8H17、C18H37、苯基等，也可以是它們被不同的基團(tuán)取代后的衍生基團(tuán)，如(CH2)2CN、(CH2)2NH2、(CH2)nOCH2OH等。 雙官能團(tuán)有機(jī)硅烷 雙官能團(tuán)化合物如R2SiX2可單獨(dú)形成線型或環(huán)狀有機(jī)硅氧烷。三官能團(tuán)有機(jī)硅烷硅烷化試劑中三個(gè)X基團(tuán)都參與硅醇基反應(yīng)的可能性很小。三官能團(tuán)化合物如RSiX3反應(yīng)后的產(chǎn)物可水解進(jìn)一步形成硅羥基，進(jìn)而形成三維交聯(lián)化合物 硅烷化試劑

7、的反應(yīng)活性為：RSiX3R2SiX2R3SiX。Si-O-Si-C：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH 28范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。聚合層鍵合相在硅膠表面與硅烷化試劑反應(yīng)時(shí)加入一定量的水，即形成聚合物，可以制備較致密的鍵合層，從而更有效地掩蔽硅膠表面的硅羥基但若反應(yīng)控制不當(dāng)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)厚的聚合網(wǎng)，而引起傳質(zhì)較慢，柱效降低 （4）端基封尾殘余的硅醇基會(huì)對(duì)鍵合相的分離性能產(chǎn)生一定影響，特別是在非極性鍵合相的情況下，硅醇基的存在會(huì)降低硅膠表面的疏水性，而對(duì)極性化合物或溶劑產(chǎn)生吸附，使鍵合相的分離性能改變。原 因（4）端基封尾用氯化三甲基硅烷等試劑與硅膠表面的殘留硅醇基反應(yīng)，將殘留硅醇基封鎖起來(lái)的化學(xué)處理過(guò)程稱為端基封

8、尾。定 義（4）端基封尾為了進(jìn)一步消除殘留的游離硅醇基，一般在鍵合反應(yīng)后再用封尾劑鈍化，也可用十八烷基三氯硅烷再鍵合一次。 方 法最常用的封尾劑有三甲基氯硅烷（TMCS）和六甲基乙硅氧烷（HMDS）以外，現(xiàn)已研制出三甲基硅咪唑（TMSI） 三甲基氯硅烷十八烷基（4）端基封尾經(jīng)封尾處理的硅膠基質(zhì)固定相減小了溶質(zhì)與固定相之間的次級(jí)相互作用，使分離效果明顯改善?？筛纳茖?duì)極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離；填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好；如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。 作 用（4）端基封尾極性封尾技術(shù)制作的新型鍵合固定相也

9、較多，如AquaTM Phenonmenex、SynergiTM Hydro-RP、YMC-PACKTM ODS AQTM 雙封端以及三封端技術(shù)的色譜柱，如ZORBAX Extend-C18，ZORBAX Bonus-RP不封端的色譜柱：鍵合了帶有較大空間位阻的側(cè)鏈基團(tuán)，ZORBAX StableBond HPLC柱 進(jìn) 展2、常見(jiàn)的官能團(tuán) 十八烷基硅烷鍵合硅膠(octyldecylsilica)（ODS）氰基氨基苯基3、常用的鍵合相商品牌號(hào)安捷倫公司（Agilent）Waters公司瑞典Akzo Nobel公司Merck公司（1）Agilent公司Zorbax由著名的色譜科學(xué)家Kirklan

10、d研制，并由杜邦公司所生產(chǎn)和銷售的系列色譜填料的注冊(cè)商標(biāo)?，F(xiàn)在，Zorbax的全部生產(chǎn)線已并入Agilent公司，所以Zorbax亦全部轉(zhuǎn)入Agilent公司。 另外還有LiChrosorb、LiChrospher等。 （2）Waters公司W(wǎng)aters公司是全球性的液相色譜、質(zhì)譜及相關(guān)產(chǎn)品專業(yè)生產(chǎn)廠家，擁有實(shí)力雄厚的研究機(jī)構(gòu)和色譜柱生產(chǎn)廠，是唯一同時(shí)生產(chǎn)液相色譜儀器、化學(xué)品及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)三大液相色譜要素的專業(yè)廠商。 Waters公司旗下的色譜柱品牌有很多，如 BondapakTM，它是能經(jīng)歷20多年但性能基本上保持一致的HPLC色譜柱。XTerra色譜柱使用的雜化顆粒技術(shù)突破了化學(xué)的極限,是

11、Waters公司歷史上HPLC色譜柱銷售增長(zhǎng)最快的色譜柱家族，無(wú)論是藥物發(fā)現(xiàn)、藥物開(kāi)發(fā)，還是進(jìn)行藥物分離和純化，XTerra雜化顆粒技術(shù)都受到制藥領(lǐng)域科學(xué)家的熱烈歡迎，并在2000年度為Waters贏得R&D100大獎(jiǎng)。 （3）Merck公司 德國(guó)默克公司的高效液相色譜從1970年起步到現(xiàn)在，已有眾多知名品牌LiChrosorb、 LiChrospher、Nucleosil、Purospherstar明星家族等。（3）Merck公司 默克公司在1999年成功研制出整體化色譜柱Chromolith并完成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，使液相色譜的研究和應(yīng)用跨入了一個(gè)全新的時(shí)代。Chromolith是目前世界上分析速

12、度最快的色譜柱。2001年3月份，在美國(guó)新奧爾良舉行的國(guó)際色譜會(huì)議上Chromolith整體化色譜柱獲得“Pitticon EditorsGold Award”；同年9月份，該產(chǎn)品又獲得了第38屆“R&D 100 World Award”。（4）Akzo Nobel公司 Kromasil是瑞典Akzo Nobel公司的硅膠填料的牌號(hào)。Kromasil是一種高純度、球形硅膠填料。這種填料含碳量高，表面極性小，分離效能高?；瘜W(xué)穩(wěn)定性好，化學(xué)純度高，機(jī)械強(qiáng)度高。近年來(lái)開(kāi)始在我國(guó)市場(chǎng)上逐漸為人所知。（5）Phenomenex公司 Luna、Synergi、Biosep、PolymerX、Jupiter

13、、Rezex、Chirex、Aqua、Zebron、Prodigy、Phonogel、Curosil、Envirosep、IB-Sil、SRAR-IONA300等 （6）Supelco公司 Discovery 系列快速LC-MS產(chǎn)品是較短的色譜柱，滿足了LC-MS分析的需要 4、化學(xué)鍵合相性能評(píng)價(jià) 由于各種鍵合相均以硅膠為基質(zhì)，可以認(rèn)為是一種改性硅膠。在化學(xué)鍵合相色譜中，代表色譜保留的 k 與鍵合在硅膠表面有機(jī)基團(tuán)的覆蓋量直接有關(guān)，因而鍵合相表面改性的完全程度和重現(xiàn)性是色譜用戶和制造廠家共同關(guān)心的。重復(fù)性和改性完全程度可通過(guò)殘余羥基，覆蓋度和覆蓋均勻性表示。測(cè)定和評(píng)價(jià)的方法有微量元素分析、色譜

14、、光譜、核磁共振法等。（1）微量元素分析或熱失重法本法直接測(cè)定鍵合相的碳含量，有以下幾種表示方法： 表面鍵合官能團(tuán)濃度 表面碳覆蓋率 有機(jī)官能團(tuán)的表面覆蓋度 表面鍵合官能團(tuán)濃度 商品鍵合相：229甲基硅烷鍵合相：十八烷基硅烷鍵合相：3420由于C%隨基質(zhì)比表面積（S）和鍵合有機(jī)基團(tuán)的分子量（M）變化，所以在研究和比較的工作中采用表面鍵合相濃度表示，即單位表面積所含鍵合相的濃度（mol/m2）： W為1 g擔(dān)體上鍵合有機(jī)官能團(tuán)的質(zhì)量 （g）；M為鍵合有機(jī)官能團(tuán)的摩爾質(zhì)量（g/mol）；S為擔(dān)體比表面積（m2/g）。 表面碳覆蓋率 表面覆蓋度即硅膠表面含碳的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。式中，12為碳的原子量；Nc

15、為鍵合有機(jī)官能團(tuán)的碳數(shù)，W、M含義同上。 有機(jī)官能團(tuán)的表面覆蓋度 鍵合程度也可用有機(jī)官能團(tuán)的表面覆蓋度表示，即在單位表面積上已鍵合的有機(jī)官能團(tuán)的量（mol）與可反應(yīng)的硅醇基的量（mol）之比。 (2) 色譜法 對(duì)反相填料在甲醇-水條件下考察對(duì)芳烴、苯、萘、聯(lián)苯的分離情況。用非極性鍵合相填料正相洗脫的方法檢查殘余羥基的含量，即用庚烷作流動(dòng)相。若殘余羥基甚少，則象甲醇、丙酮等極性化合物的保留時(shí)間與tm相近，且峰形對(duì)稱。若殘余羥基甚多，則情況相反。這種方法評(píng)價(jià)較為多客觀。(3) 光譜法 這是基于Si-OH基在3750cm-1處有特征的紅外吸收譜帶，借此可以獲得某些信息。漫反射紅外光譜可區(qū)分硅氧烷（8

16、10 cm-1和1110 cm-1 ）、孤立硅羥基（3700 cm-1 ）、鄰位或偕位硅羥基（3600 cm-1 ）。魔角探頭固體核磁共振法可以區(qū)分鄰位和偕位硅羥基，但是不能區(qū)分孤立和鍵合硅羥基位點(diǎn)。 5、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題（1）硅膠鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的使用壽命取決于鍵合的有機(jī)官能團(tuán)在硅膠表面的覆蓋程度，顯然當(dāng)覆蓋量大或呈多分子覆蓋層時(shí)，會(huì)增加其穩(wěn)定性。通常，正相鍵合相的穩(wěn)定性要低于反相鍵合相。反相烷基鍵合相的穩(wěn)定性與使用的流動(dòng)相的pH值有關(guān)，通常水溶液的pH值應(yīng)保持在28之間。硅膠中的殘留硅醇基會(huì)對(duì)色譜分離產(chǎn)生不良影響。5、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題（2）鍵合相色譜分離的重現(xiàn)性 使

17、用鍵合相時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到，同一種類型的鍵合相，因生產(chǎn)廠家不同，或生產(chǎn)批號(hào)不同，而表現(xiàn)出不同的色譜分離特性。對(duì)各種型號(hào)的鍵合相，由于制備時(shí)選用基體硅膠特性的差別，和鍵合反應(yīng)時(shí)官能團(tuán)覆蓋量的不同，會(huì)產(chǎn)生“載體誘導(dǎo)選擇性的變化”。5、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題(a)(b)(c)(d)(e)在5種不同型號(hào)ODS-硅膠化學(xué)鍵合相上7種多環(huán)芳烴混合物的分離固定相: (a) HC-ODS(8.5%); (b) Lichrosorb RP-18(19.8%)(c) Partisil-10ODS-2(16%); (d) Zorbax ODS(10%);(e) -Bondapak C18(10%)(括號(hào)內(nèi)為含碳量)5、使用鍵合固定相應(yīng)注意的問(wèn)題（3）鍵合相色譜分離的選擇性 在反相色譜分析中，使用同一種ODS固定相，并用兩種極性參數(shù)P值相近，但由不同溶劑組成的流動(dòng)相時(shí)，會(huì)由于“溶劑誘導(dǎo)選擇性的變化”，而獲得不同的分析結(jié)果。(b) 32.5%四氫呋喃-水溶液， P=8.1854