食品微生物檢測方法

1、食品微生物檢測方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品微生物檢測方法1菌落總數(shù)1.1 培養(yǎng)基和試劑、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按 GB/T4789.28-2003中4.7規(guī)定成分：蛋白凍10克、牛肉膏3克、氯化鈉5克、瓊脂1520克、蒸儲水1000ml制法：將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸儲水中，加入15%氫氧化鈉溶液2ml校正PH至7.2-7.4加入瓊脂，加熱煮沸，使用權(quán)瓊脂溶化.分裝燒K,121c高壓滅菌15分鐘.注:此培養(yǎng)基可供一般細(xì)菌培養(yǎng)之用，注平板或制成斜面.如用于菌落計數(shù)，瓊脂量為1.5%;如 作成平板或斜面，則應(yīng)為2%. 磷酸鹽緩沖液：按GB/T4789.28-2003中3.22規(guī)定.成分： 磷酸二氫鉀34克

2、、1mol/l氫氧化鈉溶液175ml、蒸儲水825ml、PH7.2制法：先將磷酸鹽溶解于500ml蒸儲水中，用1mol/l氫氧化鈉溶液校正PH后,再用蒸儲水稀釋至 1000 ml.稀釋液：取儲存液1.25 ml，用蒸儲水稀釋至1000 ml,或每管10ml,121c高壓滅菌15分鐘.明膠磷酸鹽緩沖液成分:明膠2克、磷酸氫二鈉4克、蒸儲水1000ml、PH6.2制法:加熱溶解，校正PH,121c高壓滅菌15分鐘. 0.85%滅菌生理鹽水 75%乙醇設(shè)備和材料冰箱：04 c恒溫培養(yǎng)箱36 c 土 C恒溫水浴鍋46 4C均質(zhì)器或滅菌乳缽 架盤藥物天平：0500克，精確至0.5克.（6）菌落計數(shù)器.大

3、鏡4X 滅菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）(9)滅菌錐形瓶：500ml滅菌玻璃珠：直徑約5mm(11)滅菌培養(yǎng)皿直徑約90mm 滅菌試管16mrK 160mm滅菌刀、剪子、銀子等。檢驗(yàn)程序(菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1)I菌落計數(shù)II / I操作步驟檢樣稀釋及培養(yǎng)a.以無菌操作將檢樣25克(ml)剪碎放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1: 10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置均質(zhì)器中以 8000r/min10000r/min的速度處理1min,做 成1: 10的均勻稀釋液

4、。b.用1ml的滅菌吸管吸取1: 10的稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理 鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)(注意吸管不要觸及管內(nèi)稀釋液)，振搖試管，混合均勻，做成1: 100的稀釋液。c.另取1ml滅菌吸管，按上條操作方法，做 10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次， 即換用1支1ml吸管。d.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇23個適宜稀釋度，分 別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。e.吸稀釋液移入培養(yǎng)皿后，應(yīng)及時將涼至 46c營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（可放置46步C水浴 鍋保溫）注入培養(yǎng)皿約15ml并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使混合

5、均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有 1ml稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。f.待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置 36土 C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h.菌落計數(shù)方法做平板菌落計數(shù)時，可用肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌 數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。菌落計數(shù)的報告a.平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采 用兩個平板平均數(shù)，其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌 落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分 布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。

6、平板內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌 落間無明顯界線），若僅有一條鏈。可視為一個菌落；如果有不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將 每條鏈作為一個菌落計。b.稀釋度的選擇.應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乖以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例1）。.若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在 30-300之間，則視兩者之比如何來決定。 若其比值小于或等于2,應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于2,則報告其中較小的數(shù)字，（見表1中 例2及例3）。.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以箕釋倍數(shù)報告之（見表1中例4）。.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于 30,則應(yīng)按稀釋找最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)報告之

7、（見表1中例5）。.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于 1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之（見表 1中例6）。6,若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在 30-300之間，其中一部分大于300或小于30 時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表 1中例7）。c.菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實(shí)有數(shù)報告，大于100時，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有 效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算。為了縮短數(shù)字后在的零數(shù)，也可用 10的指數(shù) 來表示（見表1）。表1稀釋度選擇及菌落數(shù)報告方式例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（cfu/g）報告方式(cfu/g(ml)10-110-210-31多/、

8、可計16420一16400160002多/、可計295461 .637750380003多/、可計271602.227100270004多/、可計多/、可計313一313000310000527115一2702706000一1X10107多/、可計30512一30500310002大腸菌群的檢測大腸菌群的測定設(shè)備和材料恒溫培養(yǎng)箱：36 土 C。冰箱：04C。 恒溫水浴鍋：44.5 =0.5 Co 架盤藥物天平：0500g精確至0.5g。顯微鏡10 X100X。均質(zhì)器或乳缽。平皿：直徑為90mm。 試管 16mrK 160mm。吸管 1ml(具 0.01ml 刻度)、10ml(具 0.1ml 刻

9、度)。 廣口瓶或三角燒瓶：容量為 500mL 0(11)玻璃珠：直徑約5mm 0載玻片。酒精燈。(14)試管架。(15)滅菌刀、剪子、鑲子培養(yǎng)基和試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管：成分：蛋白陳：20g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)：5g孚L糖：10g0.04%M甲酚紫水溶液：25ml蒸儲水：1000mlPH: 7.4制法：將蛋白陳、膽鹽及乳糖溶于水，校正 PH,加入指示劑，分裝每管10ml,并放 入一個小倒管，115c高壓滅菌15min.注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸儲水外，其他成分加倍。伊紅美藍(lán)瓊脂平板成分：蛋白陳：10g孚L糖：10g磷酸氫二鉀：2g瓊脂：17g2%伊紅Y溶液：20 ml0.65%美藍(lán)溶液：10 m

10、l 蒸儲水：1000mlPH: 7.1制法：將蛋白陳、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸儲水中，校正 ph,分裝于燒瓶內(nèi)，121c高 壓滅菌15min備用。臨用時加入乳糖并加熱溶化瓊脂，冷卻至 5055C,加入伊紅和閏藍(lán) 溶液，搖勻，傾注平板。乳糖發(fā)酵管成分：蛋白陳：20g孚L糖：10g0.04%澳甲酚紫水溶液：25ml蒸儲水：1000mlPh: 7.4制法：將蛋白陳及乳糖溶于水中，校正ph,加入指示劑，按檢驗(yàn)要求分裝30ml、10ml、 或3ml，并放入一個小倒管，115c高壓滅菌15min。注1:雙料乳糖發(fā)酵管除蒸儲水外，其他成分加倍。注2: 30ml和10ml乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗(yàn)用,3ml乳糖

11、發(fā)酵管供大腸菌群證 實(shí)試驗(yàn)用。 EC肉湯成分：胰蛋白陳：20g3號膽鹽（或混合膽鹽）：1.5g乳糖：5g磷酸氫二鉀：4g磷酸二氫鉀：1.5g氯化鈉：5g蒸儲水：1000ml制法：將上述成分混合，溶解后，分裝有發(fā)酵倒管的試管中，121c高壓滅菌15min,最終ph為6.9 02.磷酸鹽緩沖液成分：磷酸二氫鉀：34g1mol/l氫氧化鈉溶液：175 ml蒸儲水：825mlPH: 7.2制法：先將磷酸溶解于500ml蒸儲水中，用1mol/l氫氧化鈉溶液校正PH后，再用蒸 儲水稀釋至1000ml.稀釋液 取儲存液1.25ml,用蒸儲水稀釋至1000ml,分裝每瓶100ml或 每管10ml, 121C；

12、高壓滅菌15min。0.85%滅菌生理鹽水革蘭氏染色液成分：結(jié)晶紫：1g95%乙醇：20ml1%草酸錢水溶液：80ml將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸錢溶液法混合革蘭氏碘液成分：碘：1g碘化鉀：2g蒸儲水：300ml將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸儲水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸儲水至 300ml沙黃復(fù)染液成分：沙黃：0.25g95% 乙醇;10ml蒸儲水：90ml將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸儲水稀釋。染色法：a將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1min,水先。b滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。c滴加95%乙醇脫色，約30S;或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾無能為力，再用乙醇滴

13、滿整個涂片，脫色10s.d水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min。水洗，待干，鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅色。注：亦可用1： 10稀釋石炭酸復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時間公需 10s.操作步驟檢樣稀釋a以無菌操作將檢樣25mL（或g）放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌 玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1 ： 10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以 8 00010000r/min的速度處理1min,做成1 ： 10 的均勻稀釋液。b用1mL滅菌吸管吸取1 ： 10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋 液的試管內(nèi)，振搖

14、試管混勻，做成 1 ： 100的稀釋液。c另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用 1支1mL滅菌吸管。d根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度 接種3管。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管， 1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36土 C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24i2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者， 則按下列程序進(jìn)行。分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36土 C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824h,然后取出，觀

15、察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落 12個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵 管，置36土 C溫箱內(nèi)培養(yǎng)24i2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無 芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。報告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)， 查MPN檢索表，報告每100mL(g)大腸菌群的MPN 值。見附錄Ao糞大腸菌群(faecal coliform)用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物(見7.2條)轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi)，置 44.5 0.2C水浴箱內(nèi)(水浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于 EC肉湯液面)，培養(yǎng)242h,經(jīng)培養(yǎng)后，如所 有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報告為

16、陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置 36土 C培養(yǎng)1824h,凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為 糞大腸菌群陽性。結(jié)果報告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查 MPN檢索表，報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN 值。霉菌和酵母菌培養(yǎng)基和試劑滅菌蒸儲水虎紅（孟加拉紅）培養(yǎng)基 TOC o 1-5 h z 成分：蛋白陳5g葡萄糖10g磷酸二氫鉀1g硫酸鎂（含7H2O）0.5g瓊脂20g1/3000虎紅溶液100mL（四氯四碘熒光素）蒸儲水1000mL氯霉素100mg制法：將上述前5種成分加入蒸儲水中溶解后，再加入虎紅溶液。分裝后，103.43kPa, 20min

17、高壓滅菌。另用少量乙醇溶解氯霉素，過濾除菌后，加入培養(yǎng)基中，若無氯霉素， 可用鏈霉素代替，每1000mL培養(yǎng)基加鏈霉素30mgo 馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，附加抗菌素 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA） TOC o 1-5 h z 成分：馬鈴薯（去皮切塊）300g葡萄糖20g瓊脂20g蒸儲水1000mL制法:將馬鈴薯去皮切塊，力口 1000mL蒸儲水，煮沸1020min。用紗布過濾，補(bǔ)加蒸 儲水至1000mL 0加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，121c高壓滅菌20min。儀器冰箱：04 c 恒溫培養(yǎng)箱25 C -28 C恒溫振蕩器顯微鏡:10 100X 架盤藥物天平：0500克，精確至0.5克.（6

18、）菌落計數(shù)器.大鏡4X 滅菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）滅菌具塞錐形瓶:300ml 滅菌廣口瓶：500ML（11）滅菌培養(yǎng)皿直徑約90mm 滅菌試管16mrK 160mm火菌刀、金屬勺等。（14）載玻片、蓋玻片、滅菌牛皮紙袋、塑料袋操作步驟 以無菌操作取檢樣25克（ML）,放放含有225ML滅菌水的具玻塞錐形瓶中，振搖 30 分鐘，即為1: 10稀釋液。 用滅菌吸管吸取1: 10稀釋液10ML,注入滅菌試管中，另1ML滅菌吸管反復(fù)吸取款 50次，使霉菌抱子充爭散開。 用1ml的滅菌吸管吸取1:10的稀釋液注入含有9ml滅菌水的試管內(nèi)，另取一支取1ML 滅菌吸

19、管吹吸五次，此液為1: 100的稀釋液。 按上述操作順序做工10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支 1ML滅菌吸管，根據(jù) 對樣品污染情況的估計，選擇三個合適的稀釋度，分別在做10倍稀釋的同時，吸取1ML稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做二個平皿，然后將晾置 45度左右的培養(yǎng)基注入平皿 中，并轉(zhuǎn)動使之與樣液混勻，待瓊脂凝固后，倒置于2528度的溫箱中，三天后開始觀察，共培養(yǎng)觀察五天。 計算方法：通常選擇菌落數(shù)在 10150之間的平皿進(jìn)行計數(shù)，同稀釋度的兩個平皿的 菌落數(shù)平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）檢樣中所含霉菌和酵母菌。稀釋度選擇 及菌落報告方式可參考GB/T4789。2 報告：每克（或

20、亳升）食品所含霉菌和酵母菌數(shù)以cfu/g （ml）計。沙門氏菌檢測方法前增菌和增菌以無菌操作取25g (ml)樣品，加在裝有225ml緩沖蛋白陳水的500ml廣口瓶內(nèi)。固 體產(chǎn)品先用乳缽加滅菌砂磨碎，于 36c 1C培養(yǎng)4h,移植10ml轉(zhuǎn)種于100ml氯化鎂孔 雀綠增菌液內(nèi)，于42c培養(yǎng)18h-24h0同時，另取10ml轉(zhuǎn)種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增 菌液內(nèi)，于36c 1C培養(yǎng)18h-24h0分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鈿瓊脂平板和一個DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板)，兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于 36c 1C 分別培養(yǎng)18h-24h,觀察各個平板上生長的菌落，如發(fā)現(xiàn)疑似沙門桿菌的送權(quán)威質(zhì)檢部門 測定。志賀氏菌檢測方法增菌以無菌操作取25g (ml)樣品，加在裝有225mlGN增菌液的廣口瓶內(nèi)。固體產(chǎn)品先用 乳