上傳人：李***

認(rèn)證信息

認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：朱**（實(shí)名認(rèn)證）

IP屬地：遼寧

IP屬地：遼寧 上傳時(shí)間：2022-07-27 格式：DOC 頁(yè)數(shù)：6 大?。?9.50KB 積分：20 舉報(bào) 版權(quán)申訴

1、構(gòu)建重組質(zhì)?；痉椒╟DNA 編碼區(qū)片段的 PCR 擴(kuò)增50ul 區(qū)模版 1引物 1引物 1dNTP 110 八buffer 5Taq 1Milliq H2O 402. PCR 產(chǎn)物純化1、加 5 倍體積的 PB2、將 Spin 柱放于 2ml 收集管上3、加樣液， 14Krpm ，離心 1min4、棄去排出液5、加 0.75ml PE, 14Krpm ,離心 1min6、棄去排出液 ,14Krpm, 離心 1min7、將 Spin 柱放在潔凈 1.5ml 的 Epp 管中8、往Spin柱的膜中央加入 50卩I的EB （或milliq H 20,靜置2min, 14Krpm，離心 1min3.

2、 雙酶切載體和PCR產(chǎn)物分別用一下條件進(jìn)行雙酶切（反應(yīng)體系均為30ul , 37E,酶切n小時(shí)）：載體10ulPCR 產(chǎn) 物20ul10 x buffer100XBSA0.3ul100XBSA0.3ul酶11ul酶11ul酶21ul酶21ulMilliQ H2O14.7ulMilliQ H2O4.7ul10 x buffer3ul3ul?雙酶切后的載體用試劑盒割膠回收割膠并稱重，加3倍體積的QG （膠塊每100mg約合100卩I的體積）50C，恒溫10min,等到膠完全被溶解將一個(gè)Spin柱放在一個(gè)2ml的收集管中加樣液，14Krpm，離心1min棄去排出液加 0.75ml PE, 14Krp

3、m，離心 1min棄去排出液,14Krpm,離心1min將Spin柱放在潔凈1.5ml的Epp管中往Spin柱的膜中央加入 50卩l(xiāng)的EB（或milliq H 20,靜置2min, 14Krpm，離心1min連接上述雙酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化（其中載體酶切產(chǎn)物割膠回收，PCR片段酶切后純化步驟與上述PCR產(chǎn)物純化步驟相同），在 T4 DNA連接酶作用下16C連接過(guò)夜。連 接體系 如下：載體2ulPCR 片段 6ul10 xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul轉(zhuǎn)化取上述連接液5卩I轉(zhuǎn)化到預(yù)先制備的DHa化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42C 熱激2min,置冰上5min，加入Im

4、ILB培養(yǎng)液37C搖床45min,離心5000rpm, 1-5min （不 要離心太久，以免太實(shí)），最后均勻涂布在含有100 ng/mI抗生素的LB平板上（100-150 ul）。將平板在37E倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性克隆 菌落 轉(zhuǎn)劃到另一塊含有 100 ng/mI 抗生素的 LB 平板上，并對(duì)之進(jìn)行編號(hào)， 37C 倒 置培養(yǎng)過(guò)夜。菌落原位 PCR挑取轉(zhuǎn)劃后長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆菌落，加入 3ul 細(xì)菌 DNA 提取液破細(xì)胞。將細(xì)菌 裂解液作為 PCR 模板，其他 PCR 組分及 PCR 條件同上。 PCR 產(chǎn)物在 2% 凝膠上進(jìn) 行電 泳分析。QIAGEN 試劑盒抽提質(zhì)粒1 用 1.5ml 管離心收集

5、細(xì)菌，兩次，共 3ml 左右。2加入250ul的預(yù)冷的P1，打勻后在震蕩儀上高速震蕩1min。加入 250ul P2, 溫和顛倒數(shù)次混勻。（在 5min 內(nèi)）加入冰上預(yù)冷的溶液 N3 350ul ，迅速溫和顛倒混勻，至出現(xiàn) 分散 的絮狀沉淀。冰上靜置 2min 后離心， 13， 000rpm ， 10min 。小心吸取上清于藍(lán)色的 spin 柱中（勿吸到沉淀）離心 13， 000rpm ， 1min, 棄流出液加入 750ul PE, 離心 13， 000rpm ， 1min, 棄流出液9再離心一次，離心13, OOOrpm, 1min，棄流出液。以讓管內(nèi)徹底干燥。10 將 spin 柱拿出，置于一干凈的 1.5ml 管中，小心的在 spin 柱中央加入 30ul