實驗室基本技能培訓課件

1、實驗基礎知識/基本技能培訓實驗目的 謹記實驗室規(guī)程認識分子生物學實驗的主要儀器設備掌握分子生物學實驗儀器設備基本技能目 錄前言：分子生物學實驗規(guī)程第一節(jié)：分子生物學實驗設備第二節(jié)：分子生物學基本技術第三節(jié)：實驗安排前 言分子生物學實驗規(guī)程實驗規(guī)程嚴格遵守生命科學中心制定的安全規(guī)則。發(fā)現實驗室/樓內任何地方有危害安全之人、事、物等，必須立即向有關人員反映并作緊急處理。 1) 穿著規(guī)定必須按規(guī)定穿戴工作服。進行危害物質、揮發(fā)性有機溶機、特定化學物質等化學藥品操作實驗，必須要穿戴防護具（防護口罩、防護手套、防護眼鏡）。長發(fā)及松散衣服妥善固定。實驗規(guī)程2) 飲食規(guī)定禁止在實驗室吃喝食物且使用化學藥品后

2、需先洗凈雙手方能進食。 嚴禁在實驗室內吃口香糖。 禁止使用實驗室儀器冷藏/加熱食物。 實驗規(guī)程3) 藥品操作相關規(guī)定：操作危險性藥品請務必遵守操作守則或遵照老師操作流程進行實驗，勿自行更換實驗流程。 識記清楚藥品危害性，避免危害發(fā)生。實驗規(guī)程4) 用電安全相關規(guī)定：按照規(guī)定（電壓、功率）合理用電。手上有水或潮濕請勿接觸電器用品或電器設備。 掌握主要儀器、設備的性能和操作方法，嚴格按操作規(guī)程操作。 最后離開實驗室務必隨手將不用的水、電等開關關閉。如：擦拭、維修過程中要關閉電源實驗規(guī)程5) 環(huán)境衛(wèi)生相關規(guī)定：注重環(huán)境衛(wèi)生，并須保持整潔。化學物溢滿地面或工作臺時應立即選用合適的方法擦拭沖洗干凈。 嚴

3、格區(qū)分開污染區(qū)和潔凈區(qū)。 污染區(qū)：戴手套操作。潔凈區(qū)：徒手操作。實驗要求1)詳細記錄和分析實驗結果，并按時提交實驗報告；2)實驗中一定要處處用心、勤動手，多問為什么；3)仔細操作和觀察；4)保留好每一步的實驗樣品，在確準的情況下才能當廢液扔掉。第一節(jié)分子生物學實驗設備分子生物學實驗設備1) 溫度控制系統(tǒng)2) 實驗用水處理系統(tǒng)3) 消毒系統(tǒng)4) 計量系統(tǒng)5) 離心設備6) 電泳裝置7) 凝膠成像系統(tǒng)8) PCR儀9) 生物培養(yǎng)設施10) 蛋白質檢測設備11) 其他設備溫度控制系統(tǒng) 環(huán)境溫控：大部分的分子生物學實驗都要求在一定的溫度下進行操作，為了保持這些條件，實驗室應裝備空調等。 藥品、試劑、樣

4、品等的保存：不同藥品、試劑、樣品要求在不同的溫度下保存，實驗室必須備有4、20、80的冰柜/箱，需要在更低溫度下保存的樣品，則須使用液氮罐。 藥品、試劑、樣品等的取放溫度控制系統(tǒng) 低溫操作可以用制冰機制冰塊降溫； 對于需在較高溫度下進行的操作，則可使用烘箱、微波爐、恒溫水浴鍋、恒溫空氣搖床等。實驗用水 一次蒸餾水：水經過一次蒸餾，不揮發(fā)的組分殘留在容器中被除去，揮發(fā)的組分（氨、二氧化碳、有機物）進入蒸餾水的初始餾分中，通常只收集餾分的中間部分，約占60。 多次蒸餾水：在一次蒸餾水中加入堿性高錳酸鉀溶液，除去有機物和二氧化碳；加入非揮發(fā)性的酸（硫酸或磷酸），使氨成為不揮發(fā)的銨鹽。 無（去）離子水

5、：指除去了呈離子形式雜質后的純水。主要指采用離子交換樹脂處理方法，應用離子交換樹脂去除水中的陰離子和陽離子，但水中仍然存在可溶性的有機物。實驗用水處理系統(tǒng)實驗用水 超純水：既將水中的導電介質幾乎完全去除，又將水中不離解的膠體物質、氣體及有機物均去除至很低程度的水。 超純水中除了水分子(H20)外，幾乎沒有什么雜質。 各種用水，在貯存中都會被污染： 塑料容器會產生有紫外吸收的有機物； 玻璃和金屬容器會產生金屬離子的污染； 長時間放置更會使水長菌，空氣中CO2會溶入水中。 所以貯存一定要隔絕空氣，密封蓋嚴，必要時貯存在冰箱的冷藏室中；最好使用“新鮮的水”。實驗用水處理系統(tǒng)分子生物學實驗用水 普通蒸

6、餾水、二次蒸餾水、無/去離子水、超純水。實驗用水處理系統(tǒng) 常用的滅菌方法：高溫、高壓滅菌、紫外線照射、火焰焚燒、過濾除菌、酒精等試劑浸泡消毒等，因此實驗室必須配備各種無菌處理設備。 常用的滅菌儀器設備：高壓滅菌鍋、紫外燈、酒精燈、濾膜等。消毒系統(tǒng) 常用的定量系統(tǒng)有：稱量系統(tǒng)、液體體積度量系統(tǒng)、pH測定系統(tǒng)、液體溶質定量系統(tǒng)等。 稱量儀器：最常用的是電子天平。 酸堿度pH測量儀器：最常用的是pH試紙和pH計。計量系統(tǒng)液體體積度量儀器：常用的有各種量筒、移液管、容量瓶、移液器。計量系統(tǒng) 液體溶質定量儀器：主要有紫外分光光度計和可見分光光度計等。 計量系統(tǒng)實驗用離心機分為制備性離心機和分析性離心機。

7、制備性離心機主要用于分離各種生物材料。離心方法是分離和制備生物大分子最常用的手段。制備性離心機可分為三類:低速、高速（冷凍）、超速離心機。離心設備 電泳是生化實驗中最常用最重要的實驗技術之一，主要用于分析、鑒定，也可用于制備。 電泳裝置由電泳儀和電泳槽兩部分組成。 電泳儀：電泳時提供一定的電壓和電流 電泳槽：凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，根據電泳的原理，凝膠都是放在兩個緩沖腔之間，電場通過凝膠連接兩個緩沖腔。電泳裝置 電泳槽：核酸或蛋白質的電泳定性/定量分析時的凝膠支架。 電泳槽又分為水平電泳槽和垂直電泳槽。電泳裝置 是分子生物學實驗中的重要觀測儀器，幾乎全部的實驗結果都需要經由凝膠成像系統(tǒng)來觀察。

8、 可用于觀察分析各種透明或不透明的電泳圖像，包括瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA結果的觀察、PCR產物的檢測觀察，垂直板凝膠電泳檢測基因多態(tài)性的銀染膠、蛋白膠、斑點印跡（RNA/蛋白質檢測）結果的觀察等。凝膠成像系統(tǒng)紫外分析儀用于檢測許多主要生物大分子物質如蛋白質、核苷酸等。 PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶鏈式反應。其反應是用DNA聚合酶在體外大量擴增DNA片段的一種方法。 PCR儀就是將此方法實現了自動化操作的一種儀器，是分子生物學實驗常用和必備的設備。 PCR儀包括普通PCR儀、梯度PCR儀、熒光定量PCR儀。PCR儀 超凈工作臺 恒溫培養(yǎng)箱生物培養(yǎng)設施 蛋

9、白電泳槽和轉印槽-用于western-blotting實驗蛋白質檢測設備 酶標儀-用于ELISA （酶聯免疫吸附實驗）實驗。蛋白質檢測設備 實驗室除以上常規(guī)設備和設施外，還必須裝備下列一些常用設備：A.通風柜：用于有害和有毒氣體的操作。 B.組織打碎機和勻漿器：用于各種生物材料、動植物組織和細胞的破碎。（研缽）C. 超聲清洗機：用于各種器皿、移液管和自動取液器吸頭的清洗和高效液相色譜儀所用流動相的脫氣等。其它設備 其它設備 D.冰凍干燥機：用于生物大分子水溶液的冰凍干燥，可由其水溶液直接制得固體干粉。E.機械和水環(huán)式真空泵：用于旋轉蒸發(fā)器和各種真空抽氣操作。F.冷室: 4-10的冷室，工作人員

10、可以在其中進行各種柱層析、各種電泳、生物大分子的提取和分離、透析等操作，并可以貯存各種生物制品和生化試劑。G.暗室:主要用于一些避光的實驗，如顯影。H.基因導入儀：用于向受體生物細胞中導入基因。常用的導入儀有：電導入儀、基因槍、激光和超聲導入儀、原生質體融合儀等。I.高效液相色譜儀和毛細管電泳儀：用于各種生物大分子的分析與鑒定。其它設備 第二節(jié)分子生物學基本技術分子生物學基本技術-使用方法及注意事項1) 溫度控制系統(tǒng)2) 實驗用水處理系統(tǒng)3) 消毒系統(tǒng)4) 計量系統(tǒng)5) 離心設備6) 電泳裝置7) 凝膠成像系統(tǒng)1) 溫度控制系統(tǒng)冰箱/柜的使用： 門（隨手關，關嚴） 電源（防止不小心關閉）微波爐

11、： 要用微波爐專用容器（不能加熱金屬、密封物）； 不要讓微波爐空轉； 微波爐工作時不要將眼睛緊靠微波爐5厘米之內去觀看微波爐工作-眼睛對微波最敏感，以免受到不必要的傷害； 防灼傷！不要徒手拿容器、不要把容器口沖著人！1) 溫度控制系統(tǒng)制冰機的使用：（水-進水、排水；電）1不論何種原因停機時，不得連續(xù)啟動，要每隔5分鐘再啟動，以免損壞壓縮機！2定時檢查進、出水管接頭，以便處理可能泄露的少量余水！3不用時，應排掉內膽內余水，用干凈的布擦干儲冰箱內膽！5在對制冰機進行清潔、檢查及一周以上不用時，請拔掉電源插頭。1) 溫度控制系統(tǒng)液氮罐（液氮生物容器 ）的使用：液氮是一種超低溫液體(-196)，如濺到

12、皮膚上會引起類似燒傷一樣的凍傷，在灌充和取出液氮時應特別注意。液氮罐主要結構：內膽、真空夾層（容器真空封口接頭）、外殼、頸管、專用罐蓋。注意：1、液氮罐只用于盛裝液氮，不允許盛裝其他液體； 2、嚴防沖擊和碰撞； 3、操作及取放冷凍物品時，請注意要輕拿輕放； 4、長期貯存時，需要定期補充液氮。保持容器夾層真空的關鍵部件，用戶不得擅自打開容器真空封口接頭 1) 溫度控制系統(tǒng)烘箱的使用：是利用電熱絲隔層加熱使物體干燥的設備。適用于比室溫度高5300（有的高200）范圍的烘培、干燥、熱處理等，靈敏度通常為1?；窘Y構一般由箱體、電熱系統(tǒng)和自動控溫系統(tǒng)三部分組成。注意：1、每次使用前要根據烘干物品要求確

13、定合適的溫度； 2、物品不能排列太密，以免影響熱氣流動、散熱； 3、保證鼓風機正常運轉； 4、需要觀察工作室內樣品情況時，可透過玻璃門觀察。但箱門以少開為好，以免影響恒溫。特別是200以上時，開箱門可能使玻璃門驟冷而破裂。不允許整夜使用！1) 溫度控制系統(tǒng)恒溫水浴鍋、恒溫空氣搖床： 根據需要設置溫度； 恒溫水浴鍋中要保持足夠的水量。分子生物學基本技術1) 溫度控制系統(tǒng)2) 實驗用水處理系統(tǒng)3) 消毒系統(tǒng)4) 計量系統(tǒng)5) 離心設備6) 電泳裝置7) 凝膠成像系統(tǒng)防污染3) 消毒系統(tǒng) 高壓滅菌鍋1 在主體腔內加入適量的清水，將滅菌物品放入滅菌器內；2 蓋好（注意密封膠圈）頂蓋后必須擰緊頂蓋；3

14、打開滅菌器的熱源，開啟排氣閥排完空氣后（約在水沸騰后10 min15 min ）關閉排氣閥；4 將壓力升至102.9 kPa(1.05 kg/),溫度要求達121,維持到規(guī)定時間（根據物品性質以及有關情況確定,一般20 min30 min）;5 滅菌結束后,要待壓力恢復到零位后開蓋取物。對液體進行滅菌，容器不能密封、體積不能超過容積的2/3；滅菌結束后不能打開排氣閥（尤其是上排氣閥）。分子生物學基本技術1) 溫度控制系統(tǒng)2) 實驗用水處理系統(tǒng)3) 消毒系統(tǒng)4) 計量系統(tǒng)5) 離心設備6) 電泳裝置7) 凝膠成像系統(tǒng)4) 計量系統(tǒng)-質量電子天平對環(huán)境高度敏感的精密電子測量儀器, 使用時應小心操作

15、, 臺面應無明顯振動, 不要放在空調口。注意：1 調整底角螺絲使水平指示器的氣泡居中。 2 使用精密電子天平前最好熱機1520分鐘，以確保正確讀取電子天平的數值。 3 稱量物品前先按（歸零）鍵；稱樣時關上天平小門。 4 稱物品時，勿超過精密電子天平的最大稱量，且需將物品放于稱盤中心，需輕拿輕放，不要沖擊稱盤。5 嚴禁有腐蝕性的稱物直接接觸稱盤與天平面板。6 使用完畢后，要清理稱盤、面板，保持儀器清潔。4) 計量系統(tǒng)-體積依稱量需要選擇合適的器皿-各種量筒、移液管、容量瓶。移液器：量程包括：0.1-2.5 ul，0.5-10 ul，10-100 ul，20-200ul，100-1000 ul，5

16、00-5000 ul。單道可調移液器、多道可調移液器、 電子調節(jié)/顯示移液器。 Tip頭/吸頭/槍頭：10 ul（白），200 ul（黃）， 1 000 ul（藍）， 5 000 ul（白）。移液器使用方法及注意事項:1.設定移液體積 從小量程調節(jié)至大量程時，逆時針旋轉刻度；應先調至超過設定體積刻度，再回調至設定體積，這樣可以保證移液器的精確度。2裝配移液槍頭將移液槍垂直插入吸頭，左右旋轉半圈，上緊即可。忌用移液器撞擊吸頭的方法是非常不可取的，長期這樣 操作會導致移液器的零件因撞擊而松散。移液器使用方法及注意事項:3吸液及放液垂直吸液：吸液前排空氣體，吸頭尖端浸入液面3mm以下慢吸慢放；放液時

17、如果量很小則應吸頭尖端可靠容器內壁。絕不允許突然松開，以防溶液吸入過快而沖入移液器內腐蝕柱塞。4吸有液體的移液槍不應平放，槍頭內的液體很容易污染槍內部而可能導致槍的彈簧生銹。5移液槍在每次實驗后應將刻度調至最大，讓彈簧回復原型以延長移液槍的使用壽命。移液器使用方法及注意事項:6切忌吸液時突然松開；吸有液體的移液槍平放；所設量程不在移液器量程范圍內（會卡住機械裝置，損壞了移液器）；嚴禁吸取有強揮發(fā)性、強腐蝕性的液體（如濃酸、濃堿、有機物等）；使用完沒有將刻度調至最大量程。分子生物學基本技術1) 溫度控制系統(tǒng)2) 實驗用水處理系統(tǒng)3) 消毒系統(tǒng)4) 計量系統(tǒng)5) 離心設備6) 電泳裝置7) 凝膠成

18、像系統(tǒng) 一般在低速離心時（轉速小于5000 r/min），離心力的大小常用轉速r/min（rpm）來表示，而超速離心時則用離心力g或g來表示。 由于離心管從管口到旋轉中心的距離是不同的，所以在同樣轉速時，管口和管底所受到的離心力也有差別。 科技文獻中離心力的數據通常是指其平均值，即離心管中點的離心力。旋轉軸340rminravrmax5) 離心設備 低速離心機:最大轉速6000 rpm左右，最大相對離心力近6000g，通常不帶冷凍系統(tǒng)。 超速離心機：大于3010 000 r/min，最大離心力600,000g，有驅動和速度控制系統(tǒng)，溫度控制系統(tǒng)，真空系統(tǒng)（減少摩擦）。 超速離心機的出現，使生物

19、科學的研究領域有了新的擴展，它能使過去僅僅在電子顯微鏡觀察到的亞細胞器得到分級分離，還可以分離病毒、核酸、蛋白質和多糖等。5) 離心設備 高速（冷凍）離心機：最大轉速為20 000-25 000rpm（r/min），最大相對離心力為89 000g。 通常配有各種角式轉頭、蕩平式轉頭、微孔板轉頭等，一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉轉頭與空氣之間摩擦而產生的熱量，轉速、溫度和時間都可以嚴格準確地控制，并有數字顯示。 一般分子實驗室必備的設備。5) 離心設備 角式轉頭是指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉頭。離心管腔的中心軸與旋轉軸之間的角度在20-40度之間，角度越大分離效果越好。 離心過程中，重心低，

20、運轉平衡，顆粒在沉降時先沿離心力方向撞向離心管壁，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側就會出現顆粒沉積，此現象稱為“壁效應”。 壁效應容易使沉降顆粒受突然變速所產生的對流擾亂，影響分離效果。角式轉頭蕩平式轉頭： 這種轉頭有4或6個自由活動的吊桶（離心套管），當轉頭靜止時，吊桶垂直懸掛，當轉頭轉速達到每分鐘200到800轉時，吊桶蕩至水平位置。微孔板轉頭： 這種轉頭可離心高達 96孔微孔板、標準酶標板、PCR板等。 離心管主要用塑料和不銹鋼制成： 塑料離心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能較好。 塑料離心管的優(yōu)點是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出

21、梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。 塑料離心管都有管蓋，離心前管蓋必須蓋嚴，倒置不漏液。管蓋有三種作用：防止樣品外泄。用于有放射性或強腐蝕性的樣品時，這點尤其重要。防止樣品揮發(fā)。支持離心管，防止離心管變形。5) 離心設備（耗材）-離心管5) 離心設備-使用注意事項 1.離心機應放置在穩(wěn)定的臺面上，以防離心機滑動或振動，出現事故； 2.離心前必須仔細檢查轉頭各孔內有無異物、轉頭安裝是否緊固。 3.樣品的裝載和平衡：使用離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內容物；當轉頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱（保證平衡）地放在轉頭中，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。5) 離心

22、設備-使用注意事項 4.低溫離心時，轉頭及離心機要預冷后再使用。 5.裝載溶液時，要根據待離心液體的性質及體積選用適合的離心管，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕。 6.開始離心后請不要立即走開，需等待離心機達到設定轉速后再離開，注意觀察期間是否有聲音異常；發(fā)現聲音不正常時，要停機檢查，排除故障（如離心管不對稱、質量不等、離心機位置不水平或螺帽松動等）后再工作。5) 離心設備-使用注意事項 7.冷凍離心結束后，關掉電源，敞開離心機蓋子，擦拭離心機內壁，防止凝結的水氣化成水引起生銹。 8.離心中有液體濺出，需立刻清理，防止腐蝕和生銹。 9.離心時不準搬動離心機、不準開

23、蓋，不準用手停止轉頭。 10.每次停機后再開機的時間間隔不得少于5分鐘，以免壓縮機堵轉而損壞。 11、每次離心完成后，將轉子取出，否則長時間放在軸上，可能銹死。分子生物學基本技術1) 溫度控制系統(tǒng)2) 實驗用水處理系統(tǒng)3) 消毒系統(tǒng)4) 計量系統(tǒng)5) 離心設備6) 電泳裝置7) 凝膠成像系統(tǒng)結構組成： 全敞開式不漏光暗箱，防泄露紫外凝膠觀察窗，自動升降折疊式白光平臺及樣品平臺。 全自動軟件控制光源選擇、濾光片選擇、鏡頭馬達驅動變焦/聚焦以及圖像捕獲使用注意： 開機順序，先開凝膠成像系統(tǒng)，再開電腦控制軟件。 凝膠成像系統(tǒng)的門、電腦不能用污染的手套接觸。 照相后把廢膠取出，并用較軟的紙擦拭干凈。7

24、) 凝膠成像系統(tǒng)第三節(jié)實驗安排實驗安排實驗二 組織DNA的提取-（4課時）實驗三 瓊脂糖凝膠電泳- （2課時）實驗四 PCR擴增 - （2課時）實驗五聚丙烯酰胺凝膠電泳-（4課時）實驗六目的DNA片段的純化- （2課時）實驗七 DNA重組-（4課時）實驗準備準備試驗(第一次試驗拿上小眼科剪)打掃衛(wèi)生移液器：每組離開時檢查移液器數目、是否歸至最大量程；值日組最后走時再檢查數目、量程。實驗報告一（電子版）1組：分子生物學實驗室規(guī)程2組：電泳系統(tǒng)污染與非污染區(qū)操作規(guī)程3-6組：制作實驗儀器使用注意事項簡明標簽？包括：冷藏柜、空調、制冰機、液氮罐、微波爐、培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、移液器、離心機、凝膠成像系統(tǒng)大家再見依卻奔村坊精拼命喪抖磨希精心 希望 依然 飛舞 拼命 抖動 尋找 磨坊繼續(xù) 奔跑 大驚失色 千呼萬喚 垂頭喪氣10 風箏 10 風箏 我們去放風箏。一個人用手托著，另一個人牽著線，站在遠遠的地方，說聲“放”，那線一緊一松，風箏就凌空飛起，漸漸高過樹梢了。牽線人飛快地跑起來。風箏越飛越高，在空中翩翩飛舞著，我們快活地喊叫著，在田野里拼命地奔跑。村里人看見了，說：“放得這么高！”10 風箏 從早晨玩到下午，我們還是歇不下來，牽著風箏在田野里奔跑。風箏越飛越高，似乎飛到了云彩上。興奮快樂喜悅愉快樂滋滋美滋滋樂呵呵欣喜若狂興高采烈 10 風箏 從早晨