課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) (5)

1、課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+ H2O+ CO2NH33、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路.篩選菌株.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目.設(shè)置對(duì)照 1、實(shí)例：思考：科學(xué)家能從熱泉中把耐熱細(xì)菌篩選出來的原理是什么？對(duì)我們有什么啟

2、示？DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR技術(shù)）是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。 .篩選菌株要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；方法：抑制大多數(shù)微生物不能生長造成有利于該菌生長的環(huán)境，結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌

3、的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）原理：在稀釋度足夠高時(shí)

4、，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。.設(shè)置對(duì)照：實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質(zhì))小結(jié)：通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的

6、配制有問題。二.實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板三樣品的稀釋為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不

7、同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。.取樣涂布實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落

8、的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d放線菌：2528培養(yǎng)57d霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。微生物的培養(yǎng)與觀察三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個(gè)平板上長有30300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。四、操作提示 無菌操作 做好標(biāo)記 規(guī)劃時(shí)間 五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌

9、能夠分解尿素。測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征 本課題知識(shí)小結(jié):六、例題解析 例1對(duì)細(xì)菌群體生長規(guī)律測(cè)定的正確的表述是A在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B至少接種一種細(xì)菌 C接種一個(gè)細(xì)菌 D及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 解析：細(xì)菌群體生長規(guī)律的測(cè)定是人們?cè)谝欢l件下進(jìn)行的。這些條件是：一種細(xì)菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時(shí)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。在這些條件下，才能測(cè)定出細(xì)菌的生長規(guī)律。測(cè)定時(shí)只能用一種細(xì)菌的子細(xì)胞群

10、體的變化規(guī)律表達(dá)微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測(cè)細(xì)菌總數(shù)。若接種多種細(xì)菌，則會(huì)發(fā)生種間斗爭而不能測(cè)定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時(shí)，要保證一定的接種量。答案：A例2在微生物群體生長規(guī)律的測(cè)定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時(shí)期是A調(diào)整期 B對(duì)數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物對(duì)生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個(gè)個(gè)體對(duì)生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定

11、期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級(jí)代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭主要是與無機(jī)環(huán)境的斗爭。答案：C1.對(duì)細(xì)菌群體生長規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個(gè)細(xì)菌 D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練A CD4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽BC例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的