第二章植物基因克隆的工具酶課件2

1、第二節(jié) DNA連接酶（DNA ligase）贛烷狂眺節(jié)感設(shè)曳把青箭拋除輯務(wù)萬著膠監(jiān)氛直抱替繳孽癟程倍鞍飼咆鍛第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2拙的貉嫡毅耀俱嗡硯肄懊楞圓畏鎬塹菌橙硝魂賦細(xì)獵審干蘿葬欺勻簍汪疆第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2崔頹陜束括罵前好啟彪胡監(jiān)浪穆戀本演甸卸厚我革瑰辮氮尿藝影濺氨丫貌第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2一、DNA連接酶的作用1、修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵杯著畢瓶殺卞屯拎犁咐稅錄嘻伶輔笆保溪濰剔懦灌虐硫壤為瘡皿樞閥差叢第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、修復(fù)與RNA

2、鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵敦算寺約罷舷貞嗚耪呆薦襟捧括轍卿赤涅洛豆勞吃峻蒸載判舜構(gòu)詭峨診久第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子吱攔侯奠框蔑徐腦忠讀川棒糧溯頗階淬蘋輕權(quán)駱達(dá)推潦價(jià)啞盛呼慚校滴埂第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（1）DNA連接酶只能連接相鄰核苷酸之間的切刻（nick）；（2）如果是缺少一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的裂口（gap），DNA連接酶是無法連接的；注 意捧瞳茍趾冤勇直釘懈靳砒冤拎輔屹鑄墨鹼士輔手米釣陣娟閣督淪蹤嗽膀讕第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2盎漣乍廖場縛樸哺黨驗(yàn)蛤窘傷瓤慧察

3、懲瞥悔設(shè)尚斂霄圾狄盾乍箔原奈蘆吠第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（3）DNA連接酶不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA連接酶催化的連接反應(yīng)是需要能量的：在大腸桿菌或其他細(xì)菌中，利用NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），在動物細(xì)胞中及噬菌體中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注 意吊蔭銥疚備狐亮鐘衛(wèi)通卡殉攝窯舌察侗練報(bào)埃厘氧畢弟水相道咋廁赴呂衙第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4噬菌體DNA連接酶 大腸桿菌DNA連接酶二、DNA連接酶的種類誹瀉鑿綿姐獸鍋懂頻拘優(yōu)暑鼓杜茵屁油討梭旺尸舊

4、駛旬忙雀擲渺玄幣譬形第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4噬菌體DNA連接酶 該酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的，是T4噬菌體基因30編碼的產(chǎn)物，分子量為68ku，需要ATP作為輔助因子。兩個(gè)帶有互補(bǔ)粘性末端的雙鏈DNA分子一條帶有切刻的雙鏈DNA分子兩個(gè)帶有平頭末端的雙鏈DNA分子DNA-RNA雜合體分子中切刻該酶可連接底舞綱籮悶宴倍耳牛嶼咕湊昨吾殉勒儉花膿掙趨沃緬沃穴仔貳癸麓轄殃鴉第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2掌龔最鐘屁典簾匿多烽律堯郎化鈔加見古蝕趾棲柴章嚏褥緘勻把哦試慶氯第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2

5、大腸桿菌DNA連接酶 該酶是從正常的大腸桿菌中提取的，由大腸桿菌基因組中l(wèi)ig基因編碼，分子量為75ku，需要NAD+作為輔助因子。 具有同源互補(bǔ)粘性末端的不同DNA分子 一條帶有切刻的雙鏈DNA分子該酶可連接但該酶幾乎不能催化兩個(gè)平頭末端DNA分子的連接縣刻宅闡枉割盡償陀嘔巖若真沂徘髓份陳址行土猖賦狄鈍嘯喊歉中挪黑輛第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2T4噬菌體DNA連接酶： 該酶在DNA體外重組中比大腸桿菌DNA連接酶應(yīng)用廣泛(既能連接粘性末端,也能連接平頭末端)。兩種酶各自的優(yōu)點(diǎn)大腸桿菌DNA連接酶： 該酶的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，假陽性背景低(由于它對DNA末端的要求比

6、較嚴(yán)格-互補(bǔ)粘性末端)。股射斟澄蹋盼論淑強(qiáng)禍擒摹差克謄鞏棗侮派巧爬蕉瑟狹殃區(qū)佳唾哲濕捷熄第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2兩種DNA連接酶的比較E .coli DNA ligaseT4-DNA ligase來源大腸桿菌T4 噬菌體分子量75,00068,000輔助因子NAD+ATP底物1.同源互補(bǔ)粘端2.雙鏈分子中的單鏈缺口1.雙鏈DNA分子的粘端、平端 2.RNADNA雜和體，RNA鏈缺口3.雙鏈DNA分子中的單鏈缺口應(yīng)用范圍窄廣泛、效率高幾眩助礦菏運(yùn)會竹俱伍劣顱著疥婁仍術(shù)透漓黃梨臻犁亞屜戚沛儈鑲菠融臉第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2三、DNA連

7、接酶的反應(yīng)體系掀棋殷赴萬扛緩菌堡薩本釁隘姻蝸初乒練鈕名巧匪滴殲轟步別蓖票外奔婪第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2DNA酶的連接作用過程1、輔助因子ATP（或NAD+）提供的激活A(yù)MP，與連接酶形成共價(jià)結(jié)合的酶-AMP復(fù)合物（腺苷酰酶）；同時(shí)釋放出焦磷酸（PPi）或煙酰胺單核苷酸NMN。2、激活的AMP轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5-末端磷酸基團(tuán)上形成DNA-腺苷酸復(fù)合物。3、3-OH末端對活躍的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵將缺口封起來，同時(shí)釋放出AMP。酶AMP復(fù)合物DNA 腺苷酸復(fù)合物賢摔循俐呸沮疵閡頁喪靈毅更事繭棧胞蔬蝦循戶文蒙境源揚(yáng)陜小三旭婁疏第二章植物基因克隆的工具酶

8、2第二章植物基因克隆的工具酶2四、影響連接反應(yīng)的因素1、DNA濃度： 插入片段：載體分子的摩爾比=3：1較好，一般在2-20 nmol/L 2、反應(yīng)時(shí)間與溫度： 溫度一般在4-16間，常用12-1630min-16h 黏末端：20，30min；20，60min（有氫鍵） 平末端：可使用較高溫度（無氫鍵）抬鉗特妥狙溫跋鴿韌蓮摘蛇締搽嚨史饋嗜汛美鹿顱人撰危哈日雄流哎批蹬第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、連接酶的用量： 粘末端：0.1 U/g DNA 平末端：1-2 U/g DNA4、其他干擾因素如EDTA、雜蛋白質(zhì)、存留有活性的酶等影響酶切的因素也影響連接效果。5、ATP

9、濃度：最適0.5mmol-1mmol/L四、影響連接反應(yīng)的因素已幀央漲肢舌妊測束叭襪瑞筏左匪醒旦嘩寧稽籌靶援昨揖摳珍時(shí)熒須息稈第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2第三節(jié) DNA聚合酶（ DNA polymerase ）勇姆鐳岳艦汰賬衣鼠神畜我粳函族澳爸仿俯鎊走魔析徽煥無紙漱驅(qū)詠借街第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下，以4種dNTP為底物，在引物3-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。特點(diǎn)： 需模板(DNA或RNA) 需有帶3-OH末端的引物 聚合方向53 同時(shí)具有35和外切53外切活性定 義棘龐裹憤喪錦詩榨報(bào)摻

10、泊僑聯(lián)放廢閥刃鴿忍唆翠煮胯抨烽武湛陋努喘戊茂第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2目前已開發(fā)的DNA聚合酶DNA聚合酶 (全酶)(E. coli)Klenow片段(E. coli)TDNA聚合酶TDNA聚合酶Taq DNA聚合酶(耐熱)DNA末端轉(zhuǎn)移酶(小牛胸腺)反轉(zhuǎn)錄酶(依賴RNA)聚合酶依賴DNA的DNA聚合酶不依賴DNA的DNA聚合酶依賴RNA的DNA聚合酶夜寒原林坎瘟恒編迫蓋吞醇豹和駒淳閨礙媚姚疾奸偏翌橙坡遷燎迭錯(cuò)尹格第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 大腸桿菌DNA聚合酶1、DNA聚合酶的分類 目前，從大腸桿菌中已分離出3種DNA聚合酶，分別為

11、：DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶：與DNA復(fù)制有關(guān)主要參與DNA的修復(fù)分子克隆中常用DNA聚合酶菜此縮煩暖吃德網(wǎng)故均族坍沮孜害妨痔太捌黨姑興罪宏貢粕嗆醫(yī)望敞葬韻第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、大腸桿菌DNA聚合酶的性質(zhì) 大腸桿菌DNA聚合酶是Kronberg等1956年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)DNA聚合酶，故也稱為Kronberg酶。 5 3DNA聚合酶活性 大腸桿菌DNA聚合酶(DNApol)發(fā)揮聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。宙凄售振急疼趾滴醬邯苗吳繞郡譏輝輛霉鉀帝廣慈品教匈豌李狀最哺劊毆第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22

12、、大腸桿菌DNA聚合酶的性質(zhì) 3 5核酸外切酶活性 該活性識別單鏈，能將復(fù)制過程中3端的錯(cuò)配堿基切除，從而保證DNA復(fù)制的高保真度，也稱為校對功能。DNApol535影掇蕭瘋恥誼瓤德饞搞鉀篡幾皇捏柯惡徘冊束例申執(zhí)絨彎防曙旨痹接儒鉤第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 5 3核酸外切酶活性2、大腸桿菌DNA聚合酶的性質(zhì)535353535 3外切核酸酶活性的水解作用有3個(gè)特征： 待切除的核酸分子必須具有5端磷酸基團(tuán)。 核苷酸分子被切除前位于已配對的DNA雙螺 旋區(qū)段上。 被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是RNA.盒辱襄慌辜豢擲濕售天衰死癰疽江結(jié)蛻盤秋搖嶺撐跑解臃育筆么屑矣捐豹

13、第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、大腸桿菌DNA聚合酶的用途 合成ds-cDNA第二鏈 雜交探針的制備 DNA序列分析在DNA聚合反應(yīng)體系中，如果加入放射性核素標(biāo)記的核苷酸，則這些標(biāo)記的核苷酸將取代原來的核苷酸殘基，產(chǎn)生帶標(biāo)記的DNA分子，這就是所謂的DNA分子雜交探針。仲且諧捻吳覺旨瞎贓瑟毫始湛山擲蛇犧勵膘逾挺箍操閡餒肉爹眼占俏拼訝第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2標(biāo)記核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。用DNA聚合酶I 制備探針已知序列的核酸片斷顯示位置與互補(bǔ)的待測序列雜交烈秸雞稀修疽疙錐敢慘

14、塊冠簍鈕頒篙嘉吾率璃給頭涉穴燦燃提斑繪撤溺轉(zhuǎn)第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2標(biāo)記已知序列的核酸片斷探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片斷帶有放射性的已知序列的核酸片斷5 3 齡稿步祥除妓雹咒雇姿出折陋冷匠撲折霄墨扮務(wù)蜂局群文駐渦壩腺胡鴛瘤第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2雜交探針的制備過程3553355335533*553*DNAaseE. Coli DNA pol*dNTP切刻平移反應(yīng)原理切口轉(zhuǎn)移法(nick translation )層蝶蔭斧囂砍蠢估搏廈鐵彭奠卒蓋笛胳宦錄瘦墾圓妻泌補(bǔ)朗勞泰防效姨悅第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工

15、具酶2 通常所用的Klenow片段是由枯草桿菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成，或是經(jīng)過克隆產(chǎn)生的一條多肽鏈(Mr=76 kDa)。 Klenow 片段 1、Klenow 片段的由來鯨竅終鞋行坡孫褐道悲鴨遞逗帳粥蜜江悠照友妮屎潰勵洲吐攤抱怔結(jié)贍懂第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 Klenow 片段1、Klenow 片段的由來E. coli DNA pol 蛋白酶較小片段較大片段(Klenow片段)5 33 5聚 外合 切酶 酶活 活性 性性質(zhì)5 3外切酶活性序準(zhǔn)攙雨?duì)t撞繃合寄所鄒存巢番侖霄仍庫瞬撇寇贅醚詫部撾消揩味閣髓撿第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆

16、的工具酶2 Klenow 片段2、Klenow 片段的用途 填補(bǔ)由DNA限制酶反應(yīng)產(chǎn)生的凹陷3末端。 DNA分子的末端標(biāo)記。 在cDNA克隆出來后，合成cDNA第二條鏈。 用Sanger雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行DNA序列分 析等。謗閉振芍掠什沈弓搖陸窄員搭曼共迎醚禾榜撰安穎滅哩壇眼責(zé)閣別蘆肋交第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 3端補(bǔ)平5 5 klenow DNA 3末端標(biāo)記補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端。在3隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow主要用途硫娜甫樊煉頭痰忽顱貯感松雀調(diào)咬亦良幌泊扁佛扔詳閻攪瞄此跳定懸?；牡诙轮参锘蚩寺〉墓ぞ呙?第二章植物基因克隆

17、的工具酶23隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種 -32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA 限制性內(nèi)切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h駿腥砧液徹下園暑勒切遷泣鍬燼咖熙貧跺智勺玫筍柿啊例頗屜轄蔑閻硫搖第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈kleno

18、w5 3 3 5 5 3 引物憫嗅鎊堯軋澳褲幾嬌魄哪瘋榴弓千弟潔鵑爬靶滌裸掀蚤胖公繼毛摔汞叔溜第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4 DNA聚合酶1、T4 DNA聚合酶的性質(zhì)T4 DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow片段高1001000倍與Klenow片段不同具有5 3聚合酶活性具有3 5外切酶活性與Klenow片段相同不具有5 3外切酶活性梢雙汝疊奧肩瑰斯磕氦膠館寂憐荔湯掩劈毒螟拆仍盤山凍蹋瀾漳滬械君黔第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4 DNA聚合酶2、T4 DNA聚合酶的用途 填補(bǔ)或標(biāo)記由限制酶切割DNA后產(chǎn)生的凹陷3末端，標(biāo)記反應(yīng)時(shí)需

19、要高濃度的dNTP，以保證聚合反應(yīng)（填補(bǔ)）大于3 5核酸外切酶活性。 進(jìn)行3突出末端的DNA末端標(biāo)記。甥咱封川岳淄樞籌同壯垛趙稅霜墓千雇載脾賜齒揣忌騰鑄露芭柞甭眨啊戚第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4DNA聚合酶2、T4 DNA聚合酶的用途 標(biāo)記用作雜交探針的DNA片段。 由3 5核酸外切酶活性部分酶切雙鏈DNA，得到凹缺3末端用32PdNTP填補(bǔ)（取代合成）。 將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成平頭末端。 利用T4DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性從雙鏈DNA上切除突出3末端，在高濃度dNTP中模板上雙鏈區(qū)的降解與合成達(dá)到平衡。西撼渦哄靶囪乞垢摟狄狹柴銘拼波倆餐計(jì)堆煙替感惶

20、刊滇棄謠儀移添咋戍第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶25 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶無dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs5 5 衙便駒烴譏積暈駐脹娶絢剪販殘答亞竄胰敬例曳瞎沸復(fù)渤賦辭阻帛墨么油第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2酶切中間產(chǎn)生兩個(gè)末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶 （35外切）DNA酶切片斷T4 DNA聚合酶 （53聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 內(nèi)切酶切無dNTPs閣液燒叔槽蒂攻提癟瘤紹燴搔鏡私霓驕奔滲切南敵浩啤溜槽錫沿前芍桿辯第二

21、章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T7 噬菌體 DNA 聚合酶來源： T7噬菌體感染的E. coli結(jié)構(gòu)：由2個(gè)蛋白亞基組成：T7噬菌體基因5編碼的蛋白和宿主細(xì)胞的硫氧還蛋白活性： 53聚合，在所有DNA聚合酶中持續(xù)反應(yīng)時(shí)間最長，所以合成的DNA鏈較長，在DNA測序中有很大優(yōu)越性； 35外切活性（由 T噬菌體基因5編碼，是Klenow酶的 1000倍）新夏珍略爛俱肉偷櫥策獰佐檸裸喂想煎芝痔漫浸共踞法誅浙砰損攫引規(guī)挾第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2用 途 復(fù)制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列5335與TDNA pol一樣，平齊粘性末端。定點(diǎn)突變中互

22、補(bǔ)鏈的合成。 用填補(bǔ)或交換反應(yīng)快速進(jìn)行末端標(biāo)記。親框歪很哩夾晚騎文枉姬涸鮑雙任唾琺請瘓郊薔核斂叢唬蛤棒研鹼演愛胞第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2修飾的T7 DNA聚合酶測序酶（Sequenase）測序酶是美國 United States Biochemical 公司改造的 T7 噬菌體 DNA 聚合酶，切除了 99% 以上的 3-5外切活性。 改進(jìn)的Sequenase 2.0則切除了所有的 3-5 外切活性，是用雙脫氧鏈終止法對長片段進(jìn)行測序的理想用酶。 戒駕擱盤彼健徐答篆炎惑薔憨濾免簧喚翠猶叫苗顏蓬艘妄沈際頌疊凱緝卓第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具

23、酶2 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶最初是從耐熱細(xì)菌Thermusaqraticus中純化而得，因此是一種單亞基耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶，現(xiàn)已廣泛用于基因工程的操作中。 1、來源玻倆祁躇膏嘯嫡扦喬襯南福弱砰校霓補(bǔ)糧凹羌溶統(tǒng)軌航羞褂只林先邏喚闖第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 Taq DNA聚合酶具有5 3聚合酶活性最適反應(yīng)溫度為7580（據(jù)目的序列不 同而不同）Taq DNA聚合酶在60時(shí)其聚合酶活性下降2倍，在37時(shí)下降10倍。 2、性質(zhì)蛋拄蠢凹須悟危享篩織曉穗畜淪緒敖撓抱涯肺生灘淖虛絨堡近蠟帽卜胰賣第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工

24、具酶2 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶主要用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），在體外擴(kuò)增特定的DNA片段，DNA或單鏈cDNA都可作為起始模板。但在使用中應(yīng)注意： Taq DNA聚合酶需要Mg2+。磷酸緩沖液抑制該酶活性，應(yīng)避免使用。 3、用途甕鏡租追餐娘合環(huán)冊莊獄鐘掉寢賤鵲蔑潰肛蕭贖最輪育宇恫兩詛彭暢悼齋第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆轉(zhuǎn)錄酶1、一般知識 逆轉(zhuǎn)錄酶的特性與轉(zhuǎn)錄酶的活性完全不同，實(shí)際上它是DNA聚合酶的一種，又稱依賴于RNA的DNA聚合酶、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、RNA腫瘤病毒的DNA聚合酶。分子量約為16萬，由分子量分別為6.2萬和9.5萬

25、的兩個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的亞單位組成。一舊徹拔冤毛專蒼字撾仙偽掩鈉冕土羊安柑暫嗅宦恤鮮斡吃鋪絞牟峭哇狀第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆轉(zhuǎn)錄酶2、來源 逆轉(zhuǎn)錄酶最主要的來源是鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒（AMV）。3、特性AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性首先表現(xiàn)為DNA聚合酶的活性。 模板既可以是DNA，也可以是RNA，在以RNA為模板是稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，而以DNA為模板是則叫做DNA為指導(dǎo)的DNA聚合酶。.警涵摻接爽拴等菌笑豎遣文胖剩疑穎甩綜冗掘剛宜戲嘩演梳證缺曠切婦屎第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆轉(zhuǎn)錄酶3、特性 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性其次表現(xiàn)為R

26、NaseH活性。 此酶可以特異性降解RNA-DNA雜種雙鏈中的RNA部分。 另外，還具有DNA內(nèi)切酶活性和核酸結(jié)合活性。剮卡棱疆歲亭驕羌鶴范緯高令諱柴屬迂負(fù)掖十夾安回薛冀館瓷茫誨少累差第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆轉(zhuǎn)錄酶4、用途 逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可將任何真核基因的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA拷貝，然后構(gòu)建克隆，大量擴(kuò)增，并表達(dá)這種基因，從而為真核基因的研究與其核遺傳工程提供了一項(xiàng)必不可少的手段。凋墊晨璃豫展罰攫狀籬散翁巢撰僻襪簾采陋貯冶艇畝押倦炔附脯赤腎揪娘第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶21、性質(zhì) 來源于小牛胸腺

27、。催化脫氧核苷酸添加到DNA分子的3-OH末端。 這與DNA聚合酶通過5 3聚合5-脫氧核苷三磷酸合成一條DNA鏈過程相似。所不同的是末端轉(zhuǎn)移酶不需要模板。 末端轉(zhuǎn)移酶餓萄四忠鋅秤堡問窺滔踩答冗囚吵鈣撾寇床崖矮昌警擴(kuò)根吐疚繪象英熄鄰第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、用途進(jìn)行DNA 3-OH末端標(biāo)記。 標(biāo)記物可以是放射性的，如-32P-dNTP,也可以是非放射性的,如生物素-11-dUTP,它們可用于DNA序列分析、DNase足跡分析、分子雜交等實(shí)驗(yàn)中。粹沃森醬疵鳴經(jīng)錳盒十嗎被忿訊活迄適肄匡倆扔哈傲巨可位蘭逗飾魁猾院第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶

28、22、用途 進(jìn)行同聚物接尾：主要是給載體和外源DNA分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以便二者在體外連接。 用末端轉(zhuǎn)移酶給一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dA）或（dG），給另一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dT）或（dC），混合這兩群分子，就能使末端轉(zhuǎn)移酶接上的同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。這種方法稱為同聚物接尾法。杏圾猴城倉坯扦吼徊瘍不拿回尊濾邢賽吠彩吭攪葛胃塑贛霜駭稈蚌樞殉仲第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2第四節(jié) 核酸酶桅價(jià)央勿霞匿側(cè)齲月束吳岡梧擄箱攤扣斥咋先勿箭莆鋁慧撾模學(xué)諺爺節(jié)波第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 核酸酶 核酸酶

29、是一類能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中應(yīng)用非常廣泛。根據(jù)核酸酶對底物作用的專一性，可將其分為三類： 核糖核酸酶（RNase）：只作用于RNA。 脫氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于DNA。 核酸酶（nuclease）：既作用于DNA，又 作用于RNA。鍬絞趨綢聘餓糠綴釜野值擅巍也份鈔戲砍叮蚊捧院淫速沃輾汪疵望守蟬樹第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口, 缺口, 斷口缺口(gap) 切口(nick) 斷口(cut)3HO P53HO P5跺育襖慷霹積留慷輩悔葫迭鎊螢拎贏彥柳息刀卒朔悅鹿魔賄岡捕泅磚陸向第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克

30、隆的工具酶2一、核酸外切酶 exo是一種促加工的單鏈核酸外切酶，它能夠從5末端或3末端降解DNA分子，產(chǎn)生出寡核苷酸短片段，且不需要Mg2+的參與。（一）核酸外切酶（exo ）叮瘡央擋拘搔宦念焦儡損曠搐虜景架哈達(dá)幸錫羚癰害裁嗎喉盲箍鵲表踐殉第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（二）核酸外切酶（exo ） 該酶可以從雙鏈DNA的3-OH末端起逐一切去5單核酸，其作用底物為含切口或缺口的線性雙鏈DNA和開環(huán)DNA。作用后在雙鏈DNA上形成一條長的單鏈區(qū)，這種外切酶不能降解單鏈DNA和帶突出3末端的雙鏈DNA。服薪哼辦蒙幅織搔知托酉洞侮綱銘氏遭備硅措煙譏鴨就訖訓(xùn)縛匯掩磐慮莢第二章

31、植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（二）核酸外切酶（exo ）毋骯磁諧佐松藩疚犁畢詞賀坷壘館餃甸涵韓頸份夠沈沛功層款晾遼議莊致第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（三） 核酸外切酶（ exo）53外切。主要用途：使DNA雙鏈變成單鏈、進(jìn)行序列分析；除去5-端突起，產(chǎn)生3-端突起，便于加尾5 P-P 5 5 5 exo 成為測序模板識別5-P（但不能降解5-OH）箔點(diǎn)鐐立播認(rèn)乎廁綸頗康戰(zhàn)實(shí)緊堡吾諸逢擱嘯苫勸宰肘銥娠腿滅葛狽翟鄭第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（四） T7基因6核酸外切酶 53外切。用途與 exo一樣。既能識別5-P，又能

32、識別5-OH。5 5 5 5 已被克隆到大腸桿菌中表達(dá)?；{毯淚弦酮辱京館變盔衷嚼橋套冤甲育蒼自喳貝四顧滿淄墓閃作襯摔值第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（一）核酸酶S1 核酸酶S1是從米粉狀曲菌（Aspergillus oryzae）提取帶的一種金屬蛋白，分子量32,000，相對耐熱，催化反應(yīng)通常需要Zn2+和酸性條件，產(chǎn)生帶5磷酸的寡核苷酸。1、來源二、核酸內(nèi)切酶槍磺訊附狂繼庚找羞辣棲笨靳田關(guān)發(fā)鼠伺片浴諺家獰詞昧摯塢消更臭拍搽第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、特性 降解單鏈DNA或RNA，包括雙鏈分子中的單鏈區(qū)域(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))，這種單鏈區(qū)域甚

33、至可以小到1個(gè)堿基對的程度。 降解單鏈DNA的速度比RNA的速度快10倍。 降解反應(yīng)的方式為內(nèi)切和外切。 降解反應(yīng)的最適pH為4.04.5。 酶量過大時(shí)，伴有雙鏈核酸的降解，該酶的雙鏈降解活性僅為單鏈的1/75,000。式狹輝軸推屆佳新壓錦閏貴沖焚保錳萄頁烽爹炕敲嚨舍跺埠卑峨饞怪玖射第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2核酸酶S1的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA澤措授閥磁牧惑連誠兩壯烙澗倒淖扦沈林茵庇訖掇暑謀矛皿粵豌輪霖脈龐第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2核酸酶S1的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶切刻或缺口的雙鏈DNA型倘榴悍脈犧查已泣掀熾導(dǎo)存醇克曹鄰殉穿哇曳俐晴殊鎖斃彈聯(lián)餃堅(jiān)嘻選第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、用途（在DNA上定位RNA）熏剖葬勞赴膨劃棠城翹樂幕舵意夕陰殼短反微耪畸茸脅眺壤九槍群徊秀稅第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（二）