細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)

1、細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)、常用培養(yǎng)基的制備肉膏湯培養(yǎng)基(brothmedium)1、成分牛肉浸膏35g蛋白胨10g氯化鈉5g蒸餾水1000ml2、制法于1000ml蒸餾水中加入上述成份，混合加熱溶解。調(diào)整pH為7.47.6,煮沸35min,用濾紙過濾。分裝于適當(dāng)容器內(nèi)，高壓滅菌103.43Kpa20min,置陰暗處或冰箱中貯存?zhèn)溆谩?、用途供一般細(xì)菌培養(yǎng)之用,亦可制備糖發(fā)酵管及瓊脂培養(yǎng)基用。肉浸湯培養(yǎng)基(infusionmedium)1、成分新鮮牛肉(去脂絞碎)500g蛋白胨10g氯化鈉5g蒸餾水1000ml2、制法取新鮮牛肉(兔肉)除去肌鍵、肌膜及脂肪,切成小塊后用絞肉機絞碎或用刀剁碎,置于糖瓷或

2、鋁制鍋中,每500g碎肉加水1000ml混合后置冰箱中過夜。次日取出肉浸液,攪拌均勻,煮沸30min并常攪拌以免沉淀燒焦。如蛋白質(zhì)已凝固,即停止加溫,補足失去水分。用紗布或絨布擠壓過濾,使所有肉汁盡量擠出,再用脫脂棉濾入大三角燒瓶內(nèi)。在濾液中加入蛋白胨(10g/L)、氯化鈉(5g/L)，再加熱使其全部溶解。調(diào)整pH至7.67.8，煮沸10min，以濾紙過濾。分裝三角燒瓶,塞好棉塞,再用厚紙將瓶口扎好,高壓滅菌103.43KPa20min,冷卻后置陰暗或冰箱中保存?zhèn)溆谩?、用途供作基礎(chǔ)培養(yǎng)基用，營養(yǎng)較肉膏湯好。一般營養(yǎng)要求不高的細(xì)菌均能生長。普通瓊脂培養(yǎng)基(agarmedium)1、成分牛肉浸膏

3、35g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂2025g蒸餾水1000ml2、制法將上述成分置于三角燒瓶中，煮沸使其溶解（須防止外溢），并補足由于蒸發(fā)失去的水分。趁熱調(diào)整pH至7.6，以絨布過濾，分裝試管或燒瓶內(nèi)，高壓滅菌103.43KPa15min。瓊脂斜面培養(yǎng)基制法：高壓滅菌后，趁瓊脂尚未凝固前，將其分裝在已滅菌的試管內(nèi)，斜放在臺面上，待凝固后即成瓊脂斜面培養(yǎng)基。瓊脂平板培養(yǎng)基制法：經(jīng)高壓滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至5055C時，打開瓶口棉塞，將瓊脂倒入已滅菌的平皿內(nèi)（直徑9cm的平皿約需培養(yǎng)基20ml）,待凝固后即成瓊脂平板培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基制成后，通常都是倒置的，這種放置既便于取放，又有利于避免水分蒸發(fā)，以

4、及保持無菌狀態(tài)。普通瓊指培養(yǎng)基亦可用市售的營養(yǎng)瓊脂粉制備。取4.5g營養(yǎng)瓊脂粉加蒸餾水100ml,高壓蒸汽滅菌后傾注平皿即成。3、用途供一般細(xì)菌培養(yǎng)用,并可作無糖培養(yǎng)基。（四）半固體瓊脂培養(yǎng)基（softagarmedium）1、成分牛肉浸液（或牛肉膏湯）100ml瓊脂0.250.5g2、制法將瓊脂加于肉浸液中,加熱溶化。以絨布過濾并分裝試管，每管約11.5ml。高壓滅菌103.43KPa20min后,直立放置,待凝固后即成高層培養(yǎng)基,保存?zhèn)溆谩?、用途保存一般菌種用,并可觀察細(xì)菌的動力。（五）血液瓊脂培養(yǎng)基（bloodagarmedium）1、配方一：成分：普通瓊脂培養(yǎng)基100ml脫纖維羊血（

5、兔血）810ml制法將高壓滅菌后的普通瓊脂培養(yǎng)基（pH7.6）加熱融化。冷至50C左右，以無菌操作加入無菌脫纖維羊血（臨用前置37C水箱中預(yù)溫30min）8“10ml，輕輕搖勻（防止產(chǎn)生氣泡），傾注于滅菌平皿內(nèi)或分裝試管內(nèi)，制成血瓊脂平板或血瓊脂斜面培養(yǎng)基。待凝固后，抽樣于37C培養(yǎng)1824h行無菌試驗，若培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長即可使用或保存于4C冰箱內(nèi)備用。用途供分離營養(yǎng)要求較高的病原菌用。2、配方二：成分牛肉膏（pH7.8）800ml硫酸鎂（493g/L）8ml脫纖維羊血80ml瓊脂2123g5g/L對氨基苯甲酸8ml制法將肉膏湯置于三角燒瓶內(nèi)，加入硫酸鎂、對氨基苯甲酸及瓊脂，混合并使液體浸濕

6、瓊脂。加熱溶解，或置于103.43kPa高壓滅菌器內(nèi)30min（可達融化與滅菌的目的）。取出后冷至50C左右，以無菌操作加入無菌脫纖維羊血或兔血，輕輕搖勻，傾注平板，凝固后，抽樣經(jīng)37C培養(yǎng)1824h,如無細(xì)菌生長，冷藏備用。用途：供已使用過抗生素及磺胺藥的病人標(biāo)本分離培養(yǎng)。（六）SS瓊脂培養(yǎng)基（Salmonella-Shigellamedium）1、成分這是一種選擇性培養(yǎng)基，SS瓊脂培養(yǎng)基配方較多，其基本原理一致。2、制法將牛肉膏、蛋白胨和瓊脂加入水中，加熱溶解。加入膽鹽、乳糖、檸檬酸鈉及檸檬酸鐵，微微加熱，使之全部溶解。調(diào)整pH至7.2后，用絨布或脫脂棉過濾。加入煌綠和中性紅水溶液，再煮沸

7、一次（無需高壓滅菌），待冷至55C左右傾注平板，凝固后將平板置37C溫箱中干燥30min后應(yīng)用或冰箱保存?zhèn)溆谩?、用途供分離培養(yǎng)腸道致病菌用。七）呂氏血清斜面培養(yǎng)基（Loefflermedium）1、成分10g/L葡萄糖肉浸液100ml動物血清（馬、牛、羊等）300ml2、制法用pH7.4肉浸液100ml,加入1g葡萄糖，溶解后與動物血清混合，分裝于中試管內(nèi)，每管45ml。放于血清凝固器內(nèi)制成斜面，加熱至80C并維持30min,待血清充分凝固，但加熱不能過高過快，否則其表面易產(chǎn)生氣泡。于第二d和第三d繼用85C滅菌1h。制成后進行無菌試驗。3、用途供分離培養(yǎng)白喉桿菌用。二、細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)（一）平

8、板劃線分離培養(yǎng)法1、原理與應(yīng)用通過劃線，將混雜的細(xì)菌在平板表面逐一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，各自形成菌落（colony）。根據(jù)菌落形態(tài)、特征挑選單個菌落,移種培養(yǎng)后,即得到純種細(xì)菌。2、材料瓊脂平板培養(yǎng)基（簡稱普通平板）。含菌標(biāo)本（如膿汁、糞便與分泌物等）。3、方法操作前先在盛培養(yǎng)基的平皿底上注明檢查標(biāo)本的名稱（或編號）、接種日期及檢查者的組別與代號。平板劃線法有幾種,可根據(jù)不同情況選用其中一種。（1）平行劃線法。（見圖20-1）此法適用于含菌不多的液體標(biāo)本，如腦脊液（CSF）、腹水、分泌物、膿汁以及稀薄的菌液等。左手斜持平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌，冷卻后，沾取一接種環(huán)標(biāo)本，先在平板的一端

9、涂開,并從此處開始向下劃密集的平行線,約占平板面積的一半。37C培養(yǎng)。將平板轉(zhuǎn)180角,從平板另一端開始也劃密集的平行線,直到劃滿平板的剩余部分。將平板底放入蓋內(nèi),接種環(huán)火焰滅菌后放下,將平板倒置,分區(qū)劃線法。(見圖20-2)此法適用于含菌多的檢測標(biāo)本，如糞便，喀痰、細(xì)菌固體培養(yǎng)物等。劃線前的操作同平行劃線法。先在平板的一端將標(biāo)本涂開并在平板的1/51/4面積上劃密集的平行線，接種環(huán)火焰滅菌。將平板轉(zhuǎn)約70角，待接種環(huán)冷卻后，使接種環(huán)通過已劃線的1區(qū)57次，以后即不與1區(qū)接觸作連續(xù)密集劃線，約占平板面積的1/4，接種環(huán)再通過火焰滅菌。再轉(zhuǎn)平板約70，如上法在第3區(qū)劃線，此后接種環(huán)不再滅菌。重復(fù)

10、上述操作在第4區(qū)劃線，劃滿余下的培養(yǎng)基表面。將平板底放入蓋內(nèi)，接種環(huán)滅菌后放下，置37C培養(yǎng)。4、結(jié)果培養(yǎng)后在第1、2區(qū)可觀察到密集的細(xì)菌菌苔。在第3、4區(qū)可見單個細(xì)菌菌落(在劃線上)。(二)純種細(xì)菌移種技術(shù)1、斜面培養(yǎng)基移種技術(shù)(1)材料瓊脂斜面培養(yǎng)基經(jīng)分離培養(yǎng)的平板培養(yǎng)物。(2)方法在瓊脂斜面培養(yǎng)基試管上部標(biāo)明移種的菌名(或編號)、接種日期、接種者的組別及代號。左手持長有細(xì)菌的平板底，右手持接種環(huán)。接種環(huán)在火焰上滅菌冷卻后，沾取平板劃線上發(fā)育良好的孤立菌落。把平板放回原處，立即用此手取斜面培養(yǎng)基斜持，用右手小指與手掌夾持棉塞，輕輕轉(zhuǎn)動后撥出棉塞，管口通過火焰滅菌。將已沾菌的接種環(huán)伸入斜面培

11、養(yǎng)基的管底部的凝固水，沿斜面培養(yǎng)基的表面從底向上劃一直線，然后再從底部向上劃連續(xù)曲折線；也可不劃直線只劃曲折線。取出接種環(huán)，管口通過火焰滅菌，塞好棉塞，放試管架上，接種環(huán)火焰滅菌后放下。向斜面培養(yǎng)基上移種的細(xì)菌如果是生長在斜面培養(yǎng)基上的，或是生長在液體培養(yǎng)基中的，則用左手同時斜持菌種管和斜面培養(yǎng)基兩個管，右手無名指、小指手掌同時拔起夾持二個棉塞。管口及接種環(huán)先經(jīng)火焰滅菌后，從菌種管取菌立即移種到斜面上，塞好棉塞，接種環(huán)火焰滅菌后放下(見圖20-4)。然后將斜面培養(yǎng)基放37C恒溫箱中培養(yǎng)24h。3、結(jié)果斜面表面形成菌苔2、液體培養(yǎng)基移種技術(shù)用于純種細(xì)菌的增菌及觀察細(xì)菌在液體環(huán)境中的生長特征(混濁生長，表面生長或沉淀生長)(1)材料肉湯培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物(大腸埃希菌、化膿性鏈球菌、枯草芽胞桿菌)(2)方法取接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌、冷卻。以“雙管移植法”左手持細(xì)菌斜面培養(yǎng)物和肉湯培養(yǎng)基兩支試管，右手持接種環(huán)，按無菌操作法取少量細(xì)菌，將沾菌的接種環(huán)按圖20-5在斜傾的接近液面的管壁上輕輕涂抹研勻，試管直立使沾附在管壁上的細(xì)菌沒入液體中，接種后放37C恒溫箱中培養(yǎng)。結(jié)果渾濁生長大腸埃希菌菌液呈均勻混濁，管底有少量沉淀。沉淀生長化膿性鏈球菌菌液管底有沉淀，菌液無明顯渾濁。菌膜生長枯草芽胞桿菌菌液表面形成膜狀物。3、半固體培養(yǎng)基移種技術(shù)(高層穿刺培養(yǎng)法)用于保存菌種及間接檢查細(xì)菌有無動力。