-HCY-染色體畸變-小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變講義課件

1、小鼠骨髓細(xì)胞染色體畸變1毒理學(xué)動物實驗的背景毒理學(xué)實驗學(xué)科整體動物實驗原則：對實驗動物的作用可以外推于人；暴露劑量(高劑量陽性模型)； 暴露途徑(與人實際相同/相似)。應(yīng)用：毒性評價試驗一般毒性試驗：急性毒性，局部毒性，慢性毒性等； 特殊毒性試驗：致癌，致畸，致突變等機(jī)制研究(轉(zhuǎn)基因動物)毒理學(xué)動物實驗進(jìn)展和趨勢： 轉(zhuǎn)基因動物模型從體內(nèi)試驗(in vivo) 體外試驗(in vitro)從整體動物試驗3R替代試驗微核試驗 染色體畸變試驗 精子畸形試驗 Ames試驗，等22微核試驗回顧3討論微核試驗結(jié)果：重點（數(shù)了PCE/NCE、多少PCE有微核）骨髓采集問題染色問題，比值偏高固定的問題，細(xì)胞數(shù)

2、量太少針對結(jié)果要進(jìn)行分析思考題要認(rèn)真對待染色體畸變試驗原理觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變稱為染色體畸變分析，又稱 細(xì)胞遺傳學(xué)試驗。優(yōu)點：將觀察細(xì)胞停留在細(xì)胞分裂中期相，用顯微鏡直接檢 查染色體畸變和染色體分離異常?？梢杂^察到裂隙、斷裂、 短片、無著絲粒環(huán)、染色體環(huán)、雙或多著絲粒染色體、染色 體粉碎等。缺點是分裂中期相分析耗時并且需要熟練技巧45染色體皺縮 形態(tài)明顯6小鼠染色體數(shù)目、核型7端著絲粒染色體實驗?zāi)康募耙饬x目的：掌握動物骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制作方法了解動物體內(nèi)染毒及染色體畸變常見類型意義：檢測受試物導(dǎo)致動物染色體畸變的能力和 畸變類型8實驗動物選擇與處理1.動物一般選用成年大鼠或小鼠，每組

3、6-10只，最好雌雄各半；死動3應(yīng)以照注腹射 腔.染毒與取樣時間一般染毒一次或多次，多次更合理。末次染毒后24h處 物，收獲細(xì)胞. 劑量最高劑量為最大耐受劑量或30%-80% LD50 。低毒物質(zhì) 最大給藥量或人使用劑量的50-100倍。設(shè)3-5個劑量組，劑量闊度在100-1000或更大。陰性對 溶劑或生理鹽水；陽性對照注射30-50mg/kg環(huán)磷酰胺，經(jīng) 注射1或2次。4. 給藥途徑原則上采用與人體接觸化學(xué)毒物相同的途徑。92 1.共20只昆明雌鼠（20g左右）2. 陽性物：環(huán)磷酰胺，40mg/kg受試物：丙烯酰胺1/8, 1/4, 1/2 LD50(180mg/kg)3. 一次染毒14:0

4、0、腹腔注射，24h后處死小鼠4.分組：分5組 每組4只小鼠，2名學(xué)生共一只實驗流程總圖收獲細(xì)胞：處死，取股骨，4ml PBS 沖 洗 ， 1500r/min10min，棄 上清，輕輕倒置瀝干低滲：輕柔打散，加入0.070mol/L KCl 6ml，37低滲30-35min，第 10min，以槍頭吹氣泡的方式再次混 勻細(xì)胞懸液，加2ml固定液， 1000r/min10min，棄上清，余 0.2ml液體固定：4ml固定液輕柔混勻，室溫靜 置15min，1000r/min離心10min， 再重復(fù)一次，留約0.1-0.2ml液體制片染色：混勻細(xì)胞，懸滴于冰凍載 玻片，晾干，姬姆薩快速染色試劑盒 染色

5、，清洗晾干閱片：低倍鏡 找良好視野， 換油鏡觀察重要24h前腹腔注射受試物2-4h前腹腔注射秋水仙素24.5h稱重、分組KCl需要 提前預(yù)熱10體重、分組和注射體積表1112腹腔注射要點？1314盡量向脊柱處剪斷15本試驗：PBS也可用：濾紙移液器吸取5mlPBS置于離 心管中注射器反復(fù)吸取PBS沖洗第二只股骨用同一PBS16自-20冰箱60%乙醇溶液中，取出玻 片25-40cm高度滴片，玻片傾斜30每個標(biāo)本制備2-3張片滴片 做好標(biāo)記 自然晾干（可以借助吹風(fēng)機(jī)） 染色（同微核試驗） 閱片：一只小鼠找到200分裂相， 觀察記錄畸變種類，計算畸變率17染色取吉姆薩染液A液，滴加載玻片1 滴，立即

6、取B液，順序滴加16滴，吸 耳球吹勻AB液，靜置10min自來 水背面沖洗載玻片，晾干閱片觀察細(xì)胞未破裂的中期分結(jié)構(gòu)異常和數(shù)低倍鏡下選擇分散良好， 裂相，油目異常細(xì)鏡下觀察并記錄染色體胞。低倍 鏡高倍 鏡油鏡18192021染色體數(shù)目計數(shù)試劑環(huán)磷酰胺：40mg/kg （2mg/ml） 秋水仙素：4mg/kg (0.2mg/ml)緩沖液：PBS（pH7.4）低滲液： 0.07mol/L KCl固定液：甲醇3份冰醋酸1份（30ml甲醇+10ml冰醋酸） 染色劑： 姬姆薩快速染色試劑盒2222；動物天平3臺；光學(xué)顯微鏡，20臺水浴鍋一臺；15ml離心機(jī)2臺； 100-1000ml移液器， 配槍頭一盒

7、器具23乳膠手套1副/人酒精棉球及干棉球若干搪瓷盤1個/人直頭眼科剪1把/人眼科鑷1把/人濾紙若干10ml離心管1支/人，PBS用50ml離心管1支/組，固定液新鮮配制離心管架15ml離心管100ml量筒1支/組，配固定液1ml注射器1人/支載玻片（冰片）45張，60%酒精浸泡，-20備用膠頭滴管2支/組玻璃染色缸及片架2個，浸泡冰片用晾片架一組學(xué)生共用一個，全班5個玻璃鉛筆1支/組25ml滴瓶2瓶/組，AB液洗耳球3個/組，共12個120mm培養(yǎng)皿2個/組，共8個60ml滴瓶2瓶，香柏油、拭鏡液鏡頭紙1本，全班實驗報告1. 實驗?zāi)康囊饬x；2. 實驗動物情況、受試物名稱、濃度；3. 實驗動物體

8、重、隨機(jī)分組、注射體積和時間；4. 實驗操作步驟；5. 記錄染色體畸變的種類和計算每張片子、每組平均畸變率；6.討論實驗中關(guān)鍵步驟和細(xì)節(jié)對結(jié)果的影響。思考題：1. 比較染色體畸變和微核試驗兩者目的意義和方法上的異同2425實驗流程總圖收獲細(xì)胞：處死，取股骨，5ml PBS 沖 洗 ， 1500r/min5min，棄 上清，輕輕倒置瀝干低滲：輕柔打散，加入0.070mol/L KCl 6ml，37低滲30-35min，第 10min，以槍頭吹氣泡的方式再次混 勻細(xì)胞懸液，加2ml固定液， 1500r/min5min，棄上清，余 0.2ml液體固定：4ml固定液輕柔混勻，室溫 5min，1500r

9、/min離心5min，再重 復(fù)一次，留約0.2ml液體制片染色：混勻細(xì)胞，懸滴于冰凍載 玻片，晾干，姬姆薩快速染色試劑盒 染色，清洗晾干閱片：低倍鏡 找良好視野， 換油鏡觀察重要24h前腹腔注射受試物2-4h前腹腔注射秋水仙素24.5h稱重、分組KCl需要 提前預(yù)熱26移液器吸取5mlPBS置于 離心管中注射器反復(fù)吸取PBS沖洗第二只股骨用同一PBS27自-20冰箱60%乙醇溶液中，取出玻片 15-25cm高度滴片，玻片傾斜30 每個標(biāo)本制備2-3張片 做好標(biāo)記 自然晾干（可以借助吹風(fēng)機(jī)） 染色（同微核試驗）滴片閱片：一只小鼠找到200分裂相， 觀察記錄畸變種類，計算畸變率28染色取吉姆薩染液A液，滴加載玻片1 滴，立即取B液，順序滴加16滴，吸 耳球吹勻AB液，