rna干擾講課講稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。rna干擾RNA干擾（RNAi）實驗原理與方法近年來的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。一、RNAi的分子機制K7TzF&通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子R

2、NA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3端都有2個堿基突出。i?M在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的

3、過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。Fzq41jiS另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.JgRYljQi2Tdo9二、如何進行RNAi試驗ispgKX6I+K(一)siRNA的設計wEW4gzs1.在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選：x*XH&VHYPERLINK/b

4、usiness/products/order2.htmt_blank/business/products/order2.htmnR;D#p%HYPERLINK/techlib/misc/siRNA_finder.htmlt_blank/techlib/misc/siRNA_finder.htmlMz:qmFAHYPERLINK/Stu/shilin/rnai.htmlt_blank/Stu/shilin/rnai.html$4SzUZ0HYPERLINK/rnadesign/default.aspx?SID=45358710t_blank/rnadesign/default.aspx?SID=

5、45358710lK7m=j24cekUID10093精華HYPERLINK/searcher.php?authorid=10093&digest=1t_blank6發(fā)帖1954金幣229克威望26點貢獻值5點交易幣5枚在線時間221(時)注冊時間2008-08-04最后登錄2010-11-082.RNAi目標序列的選取原則：pu!dqF(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。UBjq%zTuschl等建議在設計siRNA時

6、不要針對5和3端的非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區(qū)域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。n26Y7N(2)將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。&LtWT$例如使用BLAST（HYPERLINK/BLAST/t_blank/BLAST/）MF60-VE(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。t&5%?QyM3.陰性

7、對照&UJf4b|A一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。o47rt4.目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到：cw&Hgjj2HYPERLINK/catalog/category.aspx?key=49t_blank/catalog/category.aspx?key=49_UE)*lm+HYPERLINK/techlib/tb/tb_502.htmlt_blank/techlib/tb/tb_5

8、02.html2,vBCAIHYPERLINK/mmcmanus/www/siRNADB.htmlt_blank/mmcmanus/www/siRNADB.htmlqoMAMfHYPERLINK/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Publishedt_blank/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published/sR%q|L(二)siRNA的制備SqZr目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNase

9、III)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。*T$ibNVIKcT6體外制備QoI)r1.化學合成Ct(9許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成34對siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。?:NODg最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究d1!i(MaV!不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素k%Ir

10、1V2.體外轉錄q0%以DNAOligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉染的siRNAs，但是反應規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。_$.9eBz將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸

11、鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。O_2;iD2.電穿孔法IY(hO電穿孔通過將細胞暴露在短暫的高場強電脈沖中轉導分子。將細胞懸浮液置于電場中會誘導沿細胞膜的電壓差異，據認為這種電壓差異會導致細胞膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。=fLL|本帖最近評分記錄:UID10093精

12、華HYPERLINK/searcher.php?authorid=10093&digest=1t_blank6發(fā)帖1954金幣229克威望26點貢獻值5點交易幣5枚在線時間221(時)注冊時間2008-08-04最后登錄2010-11-083.DEAE-葡聚糖和polybreneF_xMU帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA分子使得DNA可以結合在細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時轉染。P#tvm,4.機械法vA?_-.J轉染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（b

13、iolisticparticle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉入細胞質或細胞核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導入細胞。moO_-i5.陽離子脂質體試劑1r4,XSk在優(yōu)化條件下將陽離子脂質體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質體帶正電，可以靠靜電作用結合到DNA的磷酸骨架上以及帶負電的細胞膜表面。因此使用陽離子脂質體轉染的原理與以前利用中性脂質體轉染的原理不同。使用陽離子脂質體試劑，DNA并沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物。據稱，一

14、個約5kb的質粒會結合2-4個脂質體。被俘獲的DNA就會被導入培養(yǎng)的細胞。現(xiàn)存對DNA轉導原理的證據來源于內吞體和溶酶體。0=0|x為了達到高的轉染效率，在轉染實驗過程中，需要注意以下幾點：iHzZw.s1.純化siRNAc4|so=在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。3%IWGmye42.避免RNA酶污染_TH&Hl微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)

15、，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。2LhEO(_3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉染的重復性&CWY,r通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。O,9X8$5H-a4.避免使用抗生素NgxO&ZpAmbion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素?？股貢诖┩傅募毎蟹e累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。

16、u=7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗JCBnFrP熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。vV2oo三、RNAi的應用前景KN|2/|1.研究基因功能的新工具fG7Jw:G已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)

17、的基因敲除技術相比，這一技術具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多，標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。Fl!AQ+t2.研究信號傳導通路的新途徑:K5V/-|V1聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜的信號傳導途徑中不同基因的上下游關系，Clemensy等應用RNAi研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導途徑,取得了與已知胰島素信息傳導通路完全一致的結果,在此基礎上分析了DSH3PX1與DACK之間的關系,證實了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶.RNAi技術較傳統(tǒng)的轉染實驗簡單、快速、重復性好，克服了轉(p/p染實驗中重組蛋白特異性聚集和轉染效率不高的缺點，因此認為RNAi技術將可能成為研究細胞信號傳導通路的新途徑。(u$!fE-et3.開展基因治療的新策略bK6,saNRNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉座子活動，防止自私基因序列過量增殖等作用，因此可以利用RNAi現(xiàn)象產生抗病毒的植物和動物，并可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區(qū)段相應的dsRNA抵抗多種病毒。:C#-O腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調