一種多克隆抗體的制備方法

1、抗體的制備方法與原理一、抗血清的制備有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價(jià)高）的抗體。（一）用于免疫的動(dòng)物作免疫用的動(dòng)物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、 山羊和豚鼠等。動(dòng)物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量，如一般制備抗丁免疫球 蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動(dòng)物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動(dòng)物應(yīng)適齡， 健壯，無感染性疾患，最好為/雄性，此外還需十分注意動(dòng)物的飼養(yǎng)，以消除動(dòng)物的個(gè)體差異以及在免疫過 程中死亡的影響。若用兔，最好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以23kg為宜（

2、二）免疫途徑免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等，一般常用皮下或背 部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性，如激素、酶、毒 素等生物學(xué)活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。（三）佐劑由于不同個(gè)體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注 射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使 參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增

3、強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和 抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是福氏佐劑(Freund adjuvant)，其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油 的比例，視需要可調(diào)整為1： 2一9 (V/V)，這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1 20mg卡 介苗就成為完全佐劑配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置41下保存?zhèn)溆?。?疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置 乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液(其中加卡介苗34mg/ml或不加)，加完后再繼續(xù)研 磨成乳劑，滴于冰水上510min內(nèi)完全不擴(kuò)散

4、為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注 射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后 即以其中一注射器作注射用。免疫佐劑免疫佐劑(immunoadjuvant )又稱非特異性免疫增生劑。本身不具抗原性，但同抗原一起或預(yù)先注射到機(jī)體內(nèi)能增強(qiáng) 免疫原性（見抗原）或改變免疫反應(yīng)類型。種類很多，目前尚無統(tǒng)一的分類方法，常用的佐劑可分為4類：無機(jī)佐劑，如 氫氧化鋁，明礬等；有機(jī)佐劑，微生物及其產(chǎn)物如分枝桿菌（結(jié)核桿菌、卡介苗）、短小桿菌、百日咳桿菌、 內(nèi)毒素、細(xì)菌提取物（胞壁酰二肽）等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核昔酸（雙鏈多聚腺昔酸、

5、尿昔 酸）、左旋咪唑、異丙肌昔等；油劑，如費(fèi)氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。弗氏佐劑目前在 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中最常用，又可分為弗氏不完全佐劑和完全佐劑兩種。不完全佐劑是油劑（石蠟油或植物油）與乳 化劑（羊毛脂或吐溫（Tween）80）相混合而成，當(dāng)其再與抗原混合，即成油包水乳劑，可用于免疫注射。在不完全佐劑中加入死的分枝桿菌，即成為弗氏完全佐劑。完全佐劑的免疫強(qiáng)度大于不完全佐劑。該佐劑主 要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不適宜于人類使用。而且動(dòng)物多次注射后也常會(huì)發(fā)生佐劑病。免疫佐劑的生物作用包括（1）抗原物質(zhì)混合佐劑注入機(jī)體后，改變了抗原的物理性狀，可使抗原物質(zhì)緩慢地釋放，延長了抗原的作用時(shí)間；（2）佐劑吸

6、附了抗原后，增加了抗原的表面積，使抗原易于被巨噬細(xì)胞吞噬（3）佐劑能刺激吞噬細(xì)胞對抗原的處理（4）佐劑可促進(jìn)淋巴細(xì)胞之間的接觸，增強(qiáng)輔助T細(xì)胞的作用（5）可刺激致敏淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。故免疫佐劑的作用可使無免疫原性物質(zhì)變成有效 的免疫原；（6）可提高機(jī)體初次和再次免疫應(yīng)答的抗體滴變（7）改變抗體的產(chǎn)生類型以及產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并使其增強(qiáng)。具備條件佐劑的條件作為一種良好的佐劑，必須具備下列條件：增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強(qiáng)抗原的免疫原性；佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時(shí)間，減低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放全 淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗

7、體；佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞并使之增生，從而增強(qiáng)了體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異 性免疫功能；良好的佐劑應(yīng)具有無毒性或副作用低的特點(diǎn)。常用佐劑的種類和制備佐劑主要可分為兩種：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌(結(jié)核分枝桿菌)以及革蘭陰 性桿菌等；另一種本身無免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。目前應(yīng)用最多的是 弗氏佐劑(Freund adjuvant)。1.弗氏佐劑弗氏佐劑是目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中最常用的佐劑，分為不完全弗氏佐劑和完全弗氏佐劑。不完全弗氏佐劑是液 體石蠟與羊毛脂混合而成，組分比為1一5: 1,可根據(jù)需要而定，通常為2: 1。不完全佐劑中加卡介苗最 終

8、濃度為220mg/ml）或死的結(jié)核分枝桿菌，即為完全弗氏佐劑（FCA ）。一般首次注射時(shí)用1/2體積F CA加上1/2體積的抗原進(jìn)行乳化，第二次或第三次注射時(shí)用不完全佐劑或不用佐劑。如不加佐劑，則抗 原量增大10-20倍。配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4C下保存?zhèn)溆?。在免疫?dòng)物前，先將弗氏佐劑與抗原按一定比例混合，佐劑和抗原體積比一般為1： 1,制備成油包水乳狀液。因?yàn)楹琒DS很易促使其乳化成油包水抗原乳化復(fù)合物，注射入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)一定要保持乳化狀態(tài)。 抗原用量視抗原分子量不同及免疫原性及免疫動(dòng)物不同而有一定差異，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和固定模式。一般是每兔（約2k

9、g重）或每羊（約20kg重）第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超過3mg。佐劑與抗原乳化可按如下方法進(jìn)行：（1）研磨法：先將佐劑加熱并取適量放入無菌的玻璃研缽內(nèi)，待冷卻后再緩緩滴入等體積的抗原溶 液，邊滴邊按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，繼續(xù)研磨一段時(shí)間，使之成為乳白 色粘稠的油包水乳劑。本法適于制備大量的佐劑抗原，缺點(diǎn)是研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大。2）注射器混合法：將等量的弗氏佐劑和抗原溶液分別吸入兩個(gè)注射器內(nèi)，兩注射器之間以一細(xì)膠管 相連，注意排凈空氣，然后交替推動(dòng)針管，直至形成粘稠的乳劑為止。本法優(yōu)點(diǎn)是容易做到無菌操作，抗原 損失少，適用于

10、制備少量的抗原乳劑。但同時(shí)難以乳化完全，個(gè)別抗原，用塑料注射器根本推不動(dòng)，而用玻 璃注射器又有滲漏。制備好的乳化劑經(jīng)鑒定才能適用。鑒定方法是將乳化劑滴入冷水中，若保持完整不分散， 成滴狀浮于水面，即乳化完全，為合格的油包水劑。（3）超聲：實(shí)驗(yàn)室條件好點(diǎn)的，比如說有超聲破碎儀的，一定要控制超聲頻率和時(shí)間，超聲容易激 發(fā)一些自由基，對抗原有未知損害。乳化方法要根據(jù)抗原和需要而定。2氫氧化鋁佐劑取5%硫酸鋁溶液250ml，在強(qiáng)烈攪拌下加入5%氫氧化鈉溶液100ml，用生理鹽水離心洗滌沉淀2次, 再懸入生理鹽水中使達(dá)250ml。免疫接種時(shí)，取適量氫氧化鋁佐劑加等體積抗原即可免疫。3.明礬佐劑鉀鋁礬硫酸

11、鋁鉀）在一定pH條件下產(chǎn)生氫氧化鋁膠體吸附抗原而產(chǎn)生佐劑效應(yīng)。制備方法是用生理鹽水溶解蛋白質(zhì)抗原，在攪拌下緩慢滴入一定量10%硫酸鋁鉀溶液，用NaOH調(diào)pH到6. 5,此時(shí)溶液變成 乳狀懸液，離心后去掉上清液，沉淀用生理鹽水洗滌二次，加入硫柳汞防腐，4C保存?zhèn)溆?。明礬佐劑一般用于肌肉注射，皮下注射容易引起肉芽腫和膿腫。4.脂質(zhì)體脂質(zhì)體包封抗原后，可使抗原延緩釋放，并且脂質(zhì)體顆粒有刺激機(jī)體免疫反應(yīng)的作用。因此，用脂質(zhì)體 包封的抗原免疫動(dòng)物可提高免疫效果。以抗原免疫動(dòng)物獲得抗血清是制備抗體的經(jīng)典方法。為了提高免疫效果，在免疫的時(shí)候，常輔以佐 劑以改變抗原的物理狀態(tài)而延長其在體內(nèi)的滯留時(shí)間，使抗原緩

12、慢釋放，同時(shí)非特異性的促進(jìn)局部吞噬細(xì)胞反應(yīng)來增強(qiáng)動(dòng)物的免疫效果。佐劑的類型較多，目前常用的還是福氏佐劑Freunds AdjuvanFA）。它是一種 對大多數(shù)抗原都有效的佐劑，但由于它的一些副作用限制了它在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上的使用。因此，福氏佐劑只能在確實(shí)需 要的情況下如使用的抗原為小分子可溶性抗原或半抗原和強(qiáng)佐劑活性時(shí)使用。FA是用礦物油（石蠟油）、乳化劑（羊 毛脂）和滅活的分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌或卡介苗組成的油包水乳化佐劑。這三種成分俱全的佐劑稱為福氏完全 佐劑（Freunds ComU ele Adjuvant FCA），不含分枝桿菌的佐劑為福氏不完全佐劑Freunds Inconrplete A

13、djuvant，F(xiàn)IA）。石蠟油因不能代謝而存留在注射的部位，這就阻礙了抗原降解或快速反應(yīng)，起到抗原儲存作用， 使抗原緩慢持續(xù)的釋放，不斷刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。乳化劑對于水溶性抗原與油穩(wěn)定地乳化是必要 的。分枝桿菌具有很強(qiáng)的免疫刺激作用，可以非特異性的激活免疫系統(tǒng)FCA用于基礎(chǔ)注射，而FIA用于輔助注射 以避免分枝桿菌蛋白引起的過敏反應(yīng)。FA皮下注射或肌內(nèi)注射可導(dǎo)致多種副作用，例如肉芽腫和無菌性膿腫的形 成。腹腔注射引起腹膜炎。由于這些嚴(yán)重的副作用，F(xiàn)A不允許用于人或動(dòng)物的疫苗接種免疫。傳統(tǒng)的免疫方案， 包括使用福氏佐劑和某些免疫程序，已不再被一些國家的權(quán)威機(jī)構(gòu)所接受。據(jù)調(diào)查，在荷

14、蘭有4%的研究人員使 用FCA ,而且，用于多克隆抗體的生產(chǎn)方案差異很大。因此，在L993年，荷蘭發(fā)布了利用動(dòng)物免疫技術(shù)制備多克 隆抗體的生產(chǎn)指南。主要規(guī)定了加強(qiáng)免疫注射的次數(shù)、免疫途徑、注射量和佐劑的使用，并且支持使用替代佐劑來替換FCA。由于FCA給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來的嚴(yán)重的副反應(yīng)，對它的使用提出了特別的限制，規(guī)定了小鼠和大鼠，頃 0. 1nd;i d:家兔0. o5 rI1;li ?:小鼠0.2nd）推薦使用量和注射途徑。（四）免疫方法抗原劑量，首次劑量為300一500從，加強(qiáng)免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2一3周加強(qiáng)免疫 一次。加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全佐劑，首次免疫時(shí)皮下注射百日咳疫苗0.

15、5ml,加強(qiáng)免疫時(shí)不必注射百日咳疫苗在第2次加強(qiáng)免疫后2周，從耳緣靜脈取2-3ml血，制備血清，檢測抗體效價(jià)（見后）。如未達(dá)到預(yù) 期效價(jià)，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止（圖2-3）。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血 清。圖2-3抗體反應(yīng)U專髭W艱差 個(gè) W姓蚪讓目（五）抗血清的采集與保存家兔是最常用以產(chǎn)生抗體的動(dòng)物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動(dòng)物以頸靜脈、動(dòng)脈取血， 鼠等小動(dòng)物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動(dòng)脈放血，一是頸動(dòng)脈入血，也可 心臟采血。取動(dòng)脈或靜脈放血時(shí)，將兔放入一個(gè)特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）夕卜，也可由另一人捉住 兔身。剪去耳緣

16、的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴(kuò)張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片，快速切開動(dòng)脈或靜脈，血液即流出，每次可收集3040ml。然后用棉球壓迫止血，凝 血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血。頸動(dòng)脈放血時(shí)，將兔仰臥，固定于兔 臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動(dòng)脈，插管，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行。收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置41下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10 min。在無菌條件，吸出血清，分裝0.050.2ml），貯于-40C以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。（六）抗血清質(zhì)量的評價(jià)在免疫期間

17、，不僅各個(gè)不同的動(dòng)物，而且同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可 能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評價(jià)后， 才可使用所取得的抗血清。效價(jià) 抗血清的效價(jià)，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價(jià)測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用雙擴(kuò)散等方法測定。前 者測定的效價(jià)極為精確。而后者則粗糙得多。（1）放射免疫法：以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育24h后，測定其結(jié)合率。通常 以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價(jià)。如某抗血清的結(jié)合率為50%時(shí)的稀釋度為1： 150

18、00，則該血清的 效價(jià)就是1： 15000。抗血清的效價(jià)，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量、孵育時(shí)間，所 用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。（測定方法見第8章）（2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判 斷抗血清中是否有抗體及其濃度。球脂板的制備：100ml pH7.1的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi)，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全 溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65左右時(shí)，加入疊氮鈉（NaN3 ），使其在溶液中的濃度為0.1%。 用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打

19、孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為501，周圍各孔內(nèi)分別加入50從11: 2、1: 4、1：8、1: 16、1: 32及不 稀釋的抗血清，37CT孵育24h,觀察有無沉淀線產(chǎn)生，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。圖2-4雙向擴(kuò)散模型圖2-5免疫擴(kuò)散試驗(yàn)特異性測定抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強(qiáng)。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血 清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗 原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計(jì)算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），

20、求出各自在IC50時(shí)的濃度，按下列公式 計(jì)算交叉反應(yīng)率。S=y/Zx100%S:交叉反應(yīng)率，y: IC50時(shí)抗原濃度，Z： IC50時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度。如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清 與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。親合力在免疫學(xué)中，親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度?？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會(huì)迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合 位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩 爾

21、（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/H, H是最小檢出 量，通常，K的范圍在1081012L/mol之間，也有高達(dá)1014L/mol的。計(jì)算親合常數(shù)的方法20余種，計(jì)算出的K都不能真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)情況，只能作為參考。（七）免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施有時(shí)不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。（1）免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動(dòng)物的數(shù)量。（2）抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子 的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。（3）制備的免疫原是否符合要求，可從偶

22、聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮， 并加以改進(jìn)。（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。（5）免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。（6）動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求， 動(dòng)物的健康情況是否良好等。二、單克隆抗體的制備1975年Kohler和Milstei發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的 雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無性繁殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué) 的研究進(jìn)入了一個(gè)高度精確的新紀(jì)元。免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)關(guān)

23、鍵之一是制備特異性強(qiáng)、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有 幾個(gè)抗原決定簇，用它免疫動(dòng)物將產(chǎn)生對各個(gè)決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個(gè)產(chǎn)生抗 體的細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廊細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的，所以它的免疫球蛋 白屬同一類型，質(zhì)地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致。單克隆抗體(M cAb )的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3。表23單克隆抗體(McAb )和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較項(xiàng)目常規(guī)免疫血清抗體McAb抗體產(chǎn)生細(xì)胞多克隆性單克隆性抗體的結(jié)合力免疫球蛋白類別及亞類特異性與親合力有效抗體含量用于常規(guī)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)

24、抗原抗體形成格子結(jié)構(gòu) 反應(yīng)）抗原抗體反應(yīng)特異性識別多種抗原決定簇特異性識別單一抗原決定簇不均一性，質(zhì)地混雜同一類屬，質(zhì)地純一批與批之間不同特異性高，抗體均一0.55.0mg/mlO 鼠腹水）0.010.1mg/ml （小鼠腹水）0.510.0g/ml（培養(yǎng)物上清液）可用單抗組合應(yīng)用（沉淀容易形成一般難形成抗體混雜，形成2分子反應(yīng)困難，不可形成2分子反應(yīng)，可逆可逆單克隆抗體的制備方法如下。（一）動(dòng)物的選擇與免疫1.動(dòng)物的選擇純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠。2 .免疫方案選

25、擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐齊U。常用佐劑：福氏 完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免疫抗原1 50厚加福氏完全佐齊皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.81ml,0.2ml點(diǎn)）I 3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip （腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip （57天后采血測其效價(jià)）I 23 周加強(qiáng)免疫，劑量50500g為宜，ip或iv （靜脈內(nèi)注射）

26、13天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：將可溶性抗原顆?；?或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免 疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對抗原的反應(yīng) 性。(2)顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量 為12x107個(gè)細(xì)胞。初次免疫 1x107/0.5ml ipI 2一3周后第二次免疫 1x107/0.5ml ipI 3周后加強(qiáng)免疫(融合前三天)1x107/0.5ml ip或ivI取脾融合細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合

27、前準(zhǔn)備(1)骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種 雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4。表2-4用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系名稱來源耐受藥物Ig鏈H LP3/X63-Ag8(X63)BALB/C 骨髓瘤MOPC-218-氮鳥嘌吟r1 KP3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)P3/X63-Ag88-氮鳥嘌吟 P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)P3/X63-Ag88-氮鳥嘌吟-KP3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)（X63XBALB/C 脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌吟 SP2/0-Ag14(S

28、P2/0)（X63XBALB/C 脾細(xì)胞）雜交瘤8-氮鳥嘌吟 F0BALB/C骨髓瘤8-氮鳥嘌吟 S194/5.XXO.BU.1P3/X63-Ag85-漠脫氧尿嘧啶核苷 MPC11-45.6TG1.7BALB/C骨髓瘤MPC-11 6-巰鳥嘌吟r2b210.RCY3.Ag1.2.3LOU大鼠骨髓瘤R2108-氮鳥嘌吟GM15006TG-A12人骨髓瘤GM15006-巰鳥嘌吟r1U-266AR人骨髓瘤U-2668-氮鳥嘌吟8（不分泌型）KKKA骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640 , DMEM 培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10% 一 20%，細(xì)胞濃度以1045x105/ml為宜，

29、最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時(shí)，可按 1： 3一1: 10的比例傳代。每3一5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用 8-氮鳥嘌吟進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性。(2)飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn) 這些細(xì)胞生長繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼 養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有： 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射

30、線照 射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2x104或105細(xì)胞/孔。2,細(xì)胞融合的步驟制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6一10周I拉頸處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，35minI用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜I用無菌注射器注入56ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）I反復(fù)沖洗，吸出沖洗液沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5 6minI用20%小牛血清（NCS ）或胎牛血清（FCS ）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1x105/mlI加入96孔板，100從孔I放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)（2）制備免疫脾細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死

31、無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次計(jì)數(shù)取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用制備骨髓瘤細(xì)胞取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心用無血清培養(yǎng)液洗2次計(jì)數(shù)，取得X107細(xì)胞備用融合將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1： 10或1:5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng) 液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇06 ）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。90s內(nèi)加入37C預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000 ）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37C水浴作用90s。加37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml

32、、2ml、3ml、4ml、5ml 和 6ml。離心，800rpm, 6min。充上清，用含20%小牛血清曲丁選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100從l 一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96 孔板。將培養(yǎng)板置37 C、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測1. HAT選擇雜交瘤細(xì)胞脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在hat選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸昔激酶 或次黃嘌吟鳥嘌吟核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以 生長繁殖。在用HAT

33、選擇培養(yǎng)1一2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3一4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落， HAT選擇培養(yǎng)液維持7一10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間， 雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時(shí)，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng) 期間，一般每2一3天換一半培養(yǎng)液。2.抗體的檢測檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸 附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞和病毒等McAb的檢

34、測。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗 原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。（四）雜交瘤的克隆化雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔 內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、 所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化。 克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì) 胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競

35、爭的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而 喪失產(chǎn)生抗體的能力?？寺』姆椒ê芏?，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。有限稀釋法克隆克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層(同細(xì)胞融合)。2)將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞為3一10個(gè)細(xì)胞/ml。取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細(xì)胞1001孵育于37C、5%CO2孵箱在第7天換液，以后每2一3天換液1次。8一9天可見細(xì)胞克隆形成，及時(shí)檢測抗體活性。將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。每個(gè)克隆應(yīng)盡快凍存。軟瓊脂培養(yǎng)法克隆軟瓊脂的配制：含有20%NC

36、S(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI1640。1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42C預(yù)熱。0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置421保溫。用上述0.5%瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為 基底層備用。按100/ml, 500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。1ml 0.5%瓊脂液(42C預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37C、5%CO2 孵箱中。4一5天后即可見針尖大小白色克隆，7一10天后，直接移種至含飼

37、養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng)。檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞的凍存及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊]有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體 能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1 X106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時(shí)，一孔就可以裝一 支安瓿凍存。細(xì)胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降至0優(yōu)放入-701超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn) 入液氮中。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查