大蒜5[1]7(共12頁)

1、- PAGE 15 -大蒜(d sun)汁對納豆發(fā)酵中芽孢形成的影響(yngxing)李金鳳 （湛江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)(jsh)學(xué)院，湛江 524048）摘要：為了提高納豆芽孢桿菌的芽孢數(shù)量，通過添加抑菌物質(zhì)大蒜汁，探究大蒜汁添加濃度、添加量對芽孢形成量的影響。結(jié)果表明，大蒜汁的最佳添加濃度和添加量為1:3，5%，后熟過程中，大蒜汁延緩了芽孢形成的時間，但提高了芽孢的產(chǎn)量。關(guān)鍵詞：納豆芽孢桿菌 大蒜汁 芽孢數(shù)量Effects of Garlic Extract on Spore Production in Fermentation of NattoLi Jinfeng(Life Scien

2、ce and Technology School,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048)Abstract: In order to improve the spore quantity of Bacillus natto, through added antibacterial thing garlic extract, effects of the concentration and addition of garlic extract on the spore production were researched. The results

3、 showed that the best concentration and addition of garlic extract were 1:3 and 5%，garlic extract not only can have prolonged the time of spore production ,but also improved the spore production in the post-maturation.Key words: Bacillus natto ; garlic extract ; spore quantity納豆（natto）是盛行于日本的一種傳統(tǒng)發(fā)酵大

4、豆食品，由納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）在一定的溫度和濕度條件下，通過發(fā)酵蒸煮大豆制備而成，它被認(rèn)為是日本人長壽的“秘方”。 新鮮成熟的納豆色澤金黃，口感酥軟，表面覆有一層粘性物質(zhì)，挑起時有長長的拉絲樣物質(zhì)，配以適宜佐料，深受日本人喜歡，被作為佐餐必不可少的風(fēng)味食品。納豆除獨(dú)特風(fēng)味外，還具有預(yù)防高血壓、抗腫瘤、抗氧化和延緩衰老等多種功效，是一種很好的保健食品。另外有試驗表明納豆芽胞桿菌能增強(qiáng)以厭氧菌為優(yōu)勢菌群的腸道正常菌群的生長，對腸桿菌和腸球菌等條件致病菌的生長有一定的抑制作用，這都有助于宿主調(diào)整腸道正常菌群，維持腸道微生態(tài)環(huán)境的平衡。納豆菌能在條件不利的

5、情況下能形成芽孢，食用后能抵制胃酸的作用，在腸道中保持較好的活力。因此，納豆芽孢桿菌的芽孢是納豆產(chǎn)品的一項重要指標(biāo)。納豆的發(fā)酵(f jio)是一個堿性發(fā)酵過程，在納豆發(fā)酵(f jio)過程中，由于納豆桿菌(gnjn)產(chǎn)生的酶可將蛋白質(zhì)分解為多肽,氨基酸和氨等。故納豆有一股特殊的味道，未必為我國人民接受,因而需加以一定的改進(jìn)。韓國在這方面已作了許多工作，如加入大蒜、胡椒等調(diào)味品，改善了納豆的口味,但對納豆所含的功能性物質(zhì)影響不大1。大蒜、生姜、洋蔥是我國飲食上傳統(tǒng)的調(diào)味品，能刺激味蕾，增強(qiáng)食欲。同時，它們也是被證明含有抑菌活性物質(zhì)的植物2。本文通過比較這三種抑菌物質(zhì)對納豆桿菌的抑制能力,從而選取

6、抑制能力較強(qiáng)的一種添加，進(jìn)行發(fā)酵。添加抑菌物質(zhì)使納豆菌在發(fā)酵過程中處于不利的環(huán)境，從而促進(jìn)芽孢的形成，通過對添加抑菌物質(zhì)優(yōu)化，研究芽孢的動態(tài)變化，從而保證納豆產(chǎn)品中納豆菌的芽孢數(shù)處于一個較高的水平，并且可以改善納豆的風(fēng)味。1 材料與方法1.1 材料1.1 .1 菌種納豆芽孢桿菌（Bacillus natto），實驗室保存1.1.2 原料 黃豆 市售優(yōu)質(zhì)黃豆，顆粒飽滿、完整、無蟲眼；大蒜、生姜、洋蔥 市售優(yōu)質(zhì)大蒜、生姜、洋蔥1.1.3 培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：蛋白胨1，葡萄糖1，磷酸氫二鈉0.2，磷酸二氫鈉0.1平板計數(shù)培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.5，酵母浸膏0.2，葡萄糖0.1，瓊脂2牛肉(ni ru)膏蛋

7、白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉(ni ru)膏0.5，蛋白(dnbi)胨1，氯化鈉0.5，瓊脂2 pH7.0 7.4。1.1.4 主要試劑蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米淀粉、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、瓊脂、氯化鈉、胰蛋白胨、pH6.86標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液、pH4.00標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液、pH9.18標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液1.1.5 主要儀器HHD型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司），水浴恒溫振蕩器（富華儀器有限公司）、超凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司），分析天平，722型可見分光光度計，LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），GZX-9140MBE數(shù)顯鼓

8、風(fēng)干燥箱，pH值測試儀(上海雷磁儀器廠)，SK-1快速混勻器，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司） 實驗方法1.2.1 大蒜汁、生姜汁、洋蔥汁的制備 優(yōu)質(zhì)生姜洗去泥沙,大蒜籽剝?nèi)ネ饷娴哪?，將洋蔥去皮、洗凈,進(jìn)行切塊,分別于滅菌的研缽中研磨至糊狀，再于離心機(jī)中6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，取上清液作為100%的大蒜汁、生姜汁、洋蔥汁，倒入已準(zhǔn)備好的無菌三角瓶中,塞緊,置于4冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.3 菌體的培養(yǎng)1.2.3.1 菌種的活化 從保存的菌種中挑取一環(huán)溶于2mL的無菌水中，用無菌移液管取0.2mL涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)24h。1.2.3.2 種子液制

9、備 取活化菌種一環(huán)接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的200mL三角瓶中，37、150r/min、搖瓶培養(yǎng)18h。1.2.4 納豆制作的基本工藝流程及簡要說明 精選的大豆稱重浸泡沖洗裝入大試管中蒸煮大豆接種發(fā)酵放入冰箱后熟成熟納豆 。 浸泡(jnpo) ：大豆與水的比例為 1：15，浸泡(jnpo)時間1224h 蒸煮 ：在高溫(gown)滅菌鍋 中 121滅菌，20min。 發(fā)酵 ： 37發(fā)酵后熟 ：5冰箱保存1.2.5 芽孢的測定方法 活菌總數(shù)計數(shù)采用周佳慶介紹的方法3 ;芽孢平板計數(shù)是在85水浴加熱15min后,采用平板菌落計數(shù)法檢測芽孢的生成量4。1.2.6 pH的測定方法 將發(fā)酵成熟的納豆

10、轉(zhuǎn)移到離心管中搗碎，先加20mL的雙 蒸水到離心管中，混合均勻后4200轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到25mL的容量瓶中，定容至刻度，用酸度計測定。2 實驗設(shè)計2.1各種抑菌物質(zhì)抑菌效果的比較方法：用濾紙片法5 取半徑7mm的滅菌濾紙片分別放入原汁液中浸泡2min，并將0.1mL納豆芽孢桿菌菌懸液涂布于固體培養(yǎng)基表面制成含菌平板，在無菌條件下用鑷子取浸泡過的濾紙片貼在含菌平板培養(yǎng)基上，置37培養(yǎng)24h，測定抑菌圈直徑，每個實驗重復(fù)2次。并繼續(xù)培養(yǎng)，觀察抑菌時間。2.2 抑菌時間的計算方法 從出現(xiàn)抑菌環(huán)開始計時，到在抑菌環(huán)中重新長出第一個菌落為止，為抑菌時間2.3 大蒜汁濃度與抑菌能力的

11、關(guān)系、以及大蒜汁最低抑菌濃度（MIC）的確定將大蒜汁配成一系列的不同濃度，大蒜汁和無菌水按11、12、13、14、15、16、17、18、19的比例分別稀釋,然后同樣采用抑菌圈法，直到?jīng)]有明顯的抑菌圈為止。2.4 納豆發(fā)酵過程中納豆桿菌(gnjn)的生長曲線取15支小試管(shgun)，分別稱取1g豆，蒸豆，進(jìn)行發(fā)酵，每2小時取一支發(fā)酵管，加入(jir)20mL無菌水稀釋（菌數(shù)在108109個/mL,且OD值成正相應(yīng)關(guān)系）6，并用混勻器使之混勻，取上層清液測定，以接種后但未進(jìn)行發(fā)酵的豆用同樣的方法稀釋為空白對照，用分光光度計測定660nm下的OD值，并繪制曲線。2.5大蒜汁對納豆桿菌芽孢形成的

12、影響72.5.1 不同濃度的大蒜汁對納豆桿菌芽孢形成的影響選取三個大蒜汁濃度，1：1（抑菌效果較強(qiáng)）、1：3、最小抑菌濃度，按照最有利于芽孢生長選擇添加量添加不同濃度的大蒜汁。發(fā)酵28h，取出后立即在85條件下水浴加熱15 min，殺死營養(yǎng)細(xì)胞，然后進(jìn)行梯度稀釋，用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，測定芽孢的形成。2.5.2 不同添加量對芽孢形成的影響 選取一個添加量的梯度1%、5%、10%分別加入大蒜汁。在豆中按接種量2%加入納豆桿菌懸液進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)納豆發(fā)酵中納豆桿菌處于對數(shù)生長期時，按照不同添加量加入大蒜汁，37繼續(xù)發(fā)酵到28小時，取出后立即在85條件下水浴加熱10 min，殺死營養(yǎng)細(xì)胞,然后進(jìn)行梯度稀

13、釋，用平板菌落計數(shù)法計數(shù)，測定芽孢的形成。2.6 后熟過程中納豆芽孢桿菌的芽孢的動態(tài)變化2.6.1 不添加大蒜汁發(fā)酵，后熟過程中納豆芽孢桿菌的芽孢的動態(tài)變化取15支大試管，稱取1g豆，用蒸餾水浸泡24h，在高溫滅菌鍋中121 ，蒸豆20min，以2%添加量加入納豆桿菌，37發(fā)酵28h，轉(zhuǎn)移，后熟。每四小時取一支管進(jìn)行梯度稀釋涂布，用平板菌落計數(shù)法計數(shù),測定芽孢的形成。2.6.2 添加大蒜汁后熟過程中納豆芽孢桿菌的芽孢動態(tài)變化 取15支大試管，按照納豆發(fā)酵流程進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)納豆發(fā)酵中納豆桿菌處于對數(shù)生長期時，添加大蒜汁。發(fā)酵到特定時間，進(jìn)行后熟。用平板計數(shù)法測定芽孢的形成情況。3 結(jié)果(ji gu

14、)與分析3.1抑菌物質(zhì)對納豆桿菌(gnjn)的抑制效果(xiogu)通過濾紙片法，測得抑制圈大小見表1。表1 抑菌物質(zhì)對納豆芽孢桿菌抑制效果的試驗結(jié)果生姜汁大蒜汁洋蔥汁抑菌圈的直徑（cm）1.84.41.52.14.31.6平均（cm）1.954.351.55根據(jù)表2中生姜、大蒜、洋蔥抑菌圈平均數(shù)的比較，表明各抑菌物質(zhì)原汁的抑菌效果為大蒜汁生姜汁洋蔥汁。生姜汁的抑菌圈平均大小為1.95cm，大蒜汁的為4.35cm，洋蔥汁的為1.55cm。由此可知大蒜汁對納豆枯草芽孢桿菌的抑制效果最好。大蒜中起到抑菌作用的功能物質(zhì)主要是大蒜素，它殺菌的能力幾乎是青霉素的100倍，另外，大蒜還含有大蒜辣素，科學(xué)研

15、究證實：大蒜辣素有很強(qiáng)的抗菌作用；洋蔥中的主要作用物質(zhì)也是大蒜素，但洋蔥中的大蒜素的含量很少，因而，洋蔥汁具有柔和的抑菌作用；生姜中的作用物質(zhì)是姜辣素，具有明顯的抑菌作用。3.2各抑菌物質(zhì)對納豆芽孢桿菌的抑制時間通過觀察至抑菌圈內(nèi)重新長出第一個菌落，確定抑菌的時間。觀察記錄的結(jié)果為：生姜汁和洋蔥汁的分別在1天內(nèi)重新長出菌落，大蒜汁重新長出菌落的時間是2天?？梢?，大蒜汁對納豆桿菌的抑制時間比較長。3.3大蒜汁的最低抑菌濃度（MIC）大蒜汁對納豆芽孢桿菌的抑制作用較強(qiáng)，通過稀釋大蒜汁確定最低抑菌濃度。由圖1可以看出，當(dāng)大蒜汁稀釋濃度到達(dá)1：7時，抑制(yzh)圈的平均大小為1.4cm，說明抑菌作用

16、為0。因此，可以得到大蒜汁的最低抑菌濃度為1：6。另外，從圖中可以得知，隨著大蒜(d sun)汁的稀釋，抑制圈的大小不斷減小，說明大蒜汁的抑菌作用與濃度大小成正比。圖1 大蒜汁的濃度與抑菌能力的關(guān)系1.41.41.651.7522.252.83.200.511.522.533.51:81:71:61:51:41:31:21:1抑菌圈大?。╟m）（注：小圓濾紙(lzh)片的直徑為1.4cm，所以抑制圈直徑為1.4cm時，抑菌作用實際上為0）3.4納豆發(fā)酵過程中納豆桿菌生長曲線的測定納豆發(fā)酵過程中納豆桿菌的生長曲線如圖3所示。由圖可以看出，納豆桿菌在016h處于延滯期，在16h24h處于生長對數(shù)期

17、，24h后進(jìn)入穩(wěn)定期。處于對數(shù)期的細(xì)菌代謝活性最強(qiáng)，生長速度最大，且對環(huán)境變化敏感。在對數(shù)期加入抑菌物質(zhì)，使得生長旺盛的納豆芽孢桿菌由于環(huán)境的變化，轉(zhuǎn)化為芽孢，以達(dá)到較高的芽孢數(shù)。因此，最適合的添加時間為1624h。圖2 納豆發(fā)酵過程中納豆桿菌生長的動態(tài)變化00.20.40.60.811.21.41.62h6h10h14h18h22h26h30h光密度OD6603.5大蒜(d sun)汁對納豆芽孢桿菌的芽孢形成(xngchng)的影響(yngxing)3.5.1大蒜汁添加濃度對納豆桿菌芽孢形成的影響 從圖1中可以知道在1：1、1：3、1：6三個濃度中，芽孢的形成呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，大蒜汁

18、在濃度為1：3時，芽孢數(shù)最高，即濃度1：3有利于芽孢的形成。顯然，添加的大蒜汁濃度過高和過低都不利于芽孢的形成?？赡苁怯捎诖笏庵瓭舛冗^高，導(dǎo)致產(chǎn)生了殺菌作用，使納豆芽孢桿菌的數(shù)量下降，從而使芽孢的形成較少；而當(dāng)大蒜汁濃度過低時，抑菌效果不大，惡劣環(huán)境條件不顯著，不能促進(jìn)芽孢的形成。圖3 不同濃度的大蒜汁對芽孢形成的影響0246810121416181：11：31：6芽孢總數(shù)（109個）3.5.2大蒜汁添加量對納豆芽孢桿菌芽孢形成的影響 實驗結(jié)果表明，隨著添加量的增加(zngji)，芽孢形成呈現(xiàn)出先上升后下降(xijing)的趨勢。添加(tin ji)量為1%時，芽孢數(shù)最小，添加量為5%，芽孢數(shù)

19、最高。大蒜汁為偏酸性液體，添加量越大，那么發(fā)酵的pH值就越低。有實驗證明8，pH值77.5時，菌體生長最好，pH值6.57.0時，最適宜芽孢的形成。另外，添加一定濃度大蒜汁的同時也添加了部分水，發(fā)酵時水的含量影響氧的供應(yīng)。納豆芽孢桿菌是好氧菌,溶氧是菌體生長和芽孢形成的重要因素，通氣量大有利于菌體生長,提高芽孢形成率11。當(dāng)大蒜汁添加量較低時，對發(fā)酵液pH值的影響不大（納豆發(fā)酵為堿性發(fā)酵，發(fā)酵液pH7.0），因而不利于芽孢的形成；當(dāng)添加量較高時，添加的水份也越多，影響了氧的供應(yīng)，從而影響芽孢的形成。圖4 蒜汁不同添加量對芽孢形成的影響00.511.522.531%5%10%芽孢總數(shù)（109個）

20、3.6后熟過程中納豆芽孢桿菌的芽孢的動態(tài)變化由圖5可知，芽孢在后熟過程中都是不斷增加，后熟一段時間后到達(dá)一個較為穩(wěn)定的水平。當(dāng)納豆發(fā)酵結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至冰箱內(nèi)低溫后熟時，納豆桿菌幾乎停止生長，營養(yǎng)體大量轉(zhuǎn)化為芽孢，從而使芽孢快速增長；后熟一段時間后，營養(yǎng)體部分死亡，芽孢也趨于穩(wěn)定。由圖5可得知，不添加大蒜汁的情況下，在后熟416h之間，芽孢不斷增加，16h后芽孢數(shù)量趨于穩(wěn)定；當(dāng)添加大蒜汁時，后熟432h之間，芽孢在不斷增加，32h后趨于穩(wěn)定。添加大蒜汁后芽孢增長的時間比未添加大蒜汁的慢，可能原因是大蒜汁延緩了芽孢的形成過程9；但當(dāng)芽孢數(shù)處于穩(wěn)定狀態(tài)時，添加大蒜汁的芽孢數(shù)明顯比未添加大蒜汁的芽孢數(shù)高

21、得多，說明添加大蒜汁可達(dá)到增大芽孢形成的效果。另外，從下圖中可知添加大蒜汁后，納豆的pH值明顯都是在8.0以下，而未添加大蒜汁時，納豆pH值比較高，幾乎都高于8.0。這是因為納豆發(fā)酵是一個堿性發(fā)酵的過程，在納豆發(fā)酵過程中，納豆桿菌產(chǎn)生的蛋白酶可將蛋白質(zhì)分解為多肽，氨基酸和氨等，可溶性氨的增多，使pH上升。添加大蒜汁后，抑制了納豆桿菌的生長，從而使納豆的pH較低。由于產(chǎn)生氨，使納豆具有獨(dú)特的氨臭味，不為我們中國人所接受，而質(zhì)量好的納豆應(yīng)盡量減少這種氨味。表明添加大蒜汁不僅可以提高芽孢的形成量，還可以改善納豆的風(fēng)味，更有利開拓納豆的中國市場。4 討論(toln)芽孢是產(chǎn)芽孢細(xì)菌在生長(shngzh

22、ng)過程中形成的一種抗逆休眠體，并非細(xì)菌生活史不可缺少的部分，它的形成受營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素的影響(yngxing)。大蒜具有高效的抑菌活性。在納豆發(fā)酵過程中添加大蒜汁，抑制納豆芽孢桿菌的生長，使納豆菌處于惡劣環(huán)境，促進(jìn)了芽孢的形成。本文通過篩選對納豆芽孢桿菌抑菌作用最強(qiáng)的抑菌物質(zhì)，確定添加的抑菌物質(zhì)，確定該物質(zhì)的最低作用濃度及作用時間。研究大蒜汁添加量、添加濃度對納豆發(fā)酵過程中芽孢形成量的影響，以及后熟過程中芽孢的動態(tài)變化。實驗結(jié)果表明，生姜、大蒜、洋蔥三種抑菌物質(zhì)中，大蒜的抑菌作用最強(qiáng)，且抑菌時間最長。生長對數(shù)期中細(xì)菌對環(huán)境變化敏感，生長能力強(qiáng)，此期間添加抑菌物質(zhì)，改變生長環(huán)境，促使芽孢的

23、形成。由納豆發(fā)酵過程中納豆桿菌生長曲線圖可知發(fā)酵16h24h到達(dá)生長對數(shù)期。添加大蒜汁的濃度為1:3和添加量為5%時，芽孢產(chǎn)量最高，這與不同濃度的大蒜汁具有不同抑菌能力以及添加進(jìn)的水分有關(guān)。在納豆后熟過程中，添加了大蒜汁后，延緩了芽孢形成的時間，但提高了芽孢的產(chǎn)量。添加大蒜汁可以達(dá)到提高芽孢產(chǎn)量的目標(biāo)；另外，添加大蒜汁還有利于改善納豆風(fēng)味。大蒜汁的抑菌時間是有限的，且納豆在冰箱內(nèi)低溫后熟過程中，納豆桿菌還在進(jìn)行低溫的熟成發(fā)酵，分解蛋白質(zhì)，時氨味增加，所以納豆后熟的時間不宜過長，應(yīng)盡快食用。致謝(zh xi)：本文是在孫鵬老師的關(guān)懷和悉心(xxn)指導(dǎo)下完成的，周仙嬌老師、藺紅萍(hn pn)老

24、師和劉淑茵、朱曉蕾同學(xué)在實驗的過程中也給予了我很大的幫助和支持，在此謹(jǐn)向他們表示衷心的感謝！參考文獻(xiàn)1 Kim,B.N.& Lee,S.Y.Han guk Yongyang Siklyyong HakhoehiJ, 1995, 24 (2): 2282332 余世望,范青生,肖小年,等.60種食藥兩用重要抗菌防腐作用研究J.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2000,11(6):1-4.3 周德慶. 微生物實驗手冊M.上海科學(xué)技術(shù)出版社,1983.3031;81834 杜連祥. 工業(yè)微生物實驗技術(shù)M. 天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社,1992.1045 Seher Kumcuoglu，Sebnem Tavman，

25、et a1Thermal conductivity Measurement of a traditional fermented dough in the frozen stateJJournal of Food Engineering，2007，78：107910826 ABRIOUEL H,MAQUEDA M,GALVEZ A,etal.Inhibition of bacterial growth, enterotoxin production,and spore outgrowth in strains of Bacillus cereus by bacteriocin AS-48J.Applied and Environme