與肺癌源性HSP70特異性結(jié)合單鏈融合抗體的篩選與序列分析

1、與肺癌源性HSP70特異性結(jié)合單鏈交融抗體的挑選與序列闡發(fā)楊繼要,張慧珍,王靜,吳逸明,買淑鵬【摘要】目的從人源性肺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)中挑選與肺癌源性HSP70特異性結(jié)合的交融抗體。要領(lǐng)以肺癌源性的HSP70為抗原,對(duì)人源性肺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)中經(jīng)四輪挑選,單克隆噬菌體抗體與抗原HSP70結(jié)合經(jīng)ELISA檢測(cè)挑選出陽(yáng)性菌株，再經(jīng)PR進(jìn)一步斷定，確定含有單鏈抗體基因的克隆并測(cè)序，測(cè)序效果通過(guò)GeneBank比對(duì)舉行同源性闡發(fā)。效果得到了1個(gè)特異性強(qiáng)的陽(yáng)性噬菌體克攏經(jīng)DNA測(cè)序后,在Genebank中與人的免疫球卵白庫(kù)舉行比對(duì),確定為單鏈抗體片斷。結(jié)論從人源性肺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)中挑選到與HSP7

2、0特異性結(jié)合的具有成效活性的單鏈交融抗體,為進(jìn)一步的HSP70可溶性抗體的制備以及以可溶性HSP70抗體為載體的藥物導(dǎo)向抗腫瘤治療奠基了基矗【關(guān)鍵詞】肺癌；噬菌體抗體庫(kù)；HSP70；挑選IdentifiatinandSequeneAnalysisfFusedsFvAntibdyBindingSpeifiallytHSP70Keyrds：Lunganer；Phageantibdylibrary；HSP70；Bipanning熱休克卵白70HeatShkPrtEin70,HSP70在許多腫瘤中高表達(dá)，研究表白1，2，腫瘤細(xì)胞的HSP70特異性表達(dá)于細(xì)胞外貌，與正常構(gòu)造細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)差異。本研究從

3、構(gòu)建的人源性肺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)中挑選抗HSP70抗體，旨在探求有臨床應(yīng)用代價(jià)的抗體，為肺癌免疫治療奠基理論基矗1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料人源性肺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)由我室張慧珍博士構(gòu)建，庫(kù)容為1.21012，-70保存。TG1大腸桿菌、K13幫助噬菌體為本實(shí)行保存。鼠抗13單克隆抗體購(gòu)自Aersha公司。鼠抗人HSP70一抗、兔抗鼠二抗購(gòu)自北京中山公司，抗原HSP70由我研究室從肺癌構(gòu)造中提取總卵白，顛末nA親和柱、透析、DEAE離子互換柱得到，經(jīng)ESTERN-BLT斷定具有抗原性。胰酶及其他試劑為國(guó)產(chǎn)闡發(fā)純。1.2要領(lǐng)(1)噬菌體抗體庫(kù)的擴(kuò)增取100l原庫(kù)菌液，接種到100l2YT-AG含100

4、g/l氨芐青霉素，1%葡萄糖的2YT造就基中，37振蕩造就至D6000.4；加1l幫助噬菌體K13于25l造就液，37水浴30in，4離心后棄上清；用50l2YT-AK含100g/l氨芐青霉素，50g/l卡那霉素的2YT重懸沉淀，37造就留宿；4離心，上清即為擴(kuò)增后的噬菌體抗體庫(kù)。加10lPEG/Nal于上清中，冰浴1h后離心棄上清，用PBS洗滌沉淀，再重懸于含15%甘油的PBS中，-70保存。(2)抗體庫(kù)滴度測(cè)定取1l濃縮后的抗體庫(kù)上清，用PBS100倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度均參加900l奇怪制備的大腸桿菌TG1D6000.4，37水浴30in后涂TYE平板，37造就留宿。越日計(jì)數(shù)菌落預(yù)計(jì)噬菌

5、體抗體滴度：用噬菌體顆粒的菌落形成單元表現(xiàn)，pfu/l集落數(shù)稀釋倍數(shù)。定量稀釋到11012pfu/l保存。(1)從單個(gè)含噬菌粒細(xì)菌克隆制備交融抗體從每一輪挑選后留宿造就的TYE平板上隨機(jī)挑取12個(gè)單個(gè)細(xì)菌克隆，接種到含200l2YT-AG的酶標(biāo)板孔中，37振蕩造就留宿，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟為母板；另取一塊酶標(biāo)板，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟為檢測(cè)板，每孔加200l2YT-AG，從母板中取10l留宿造就物于檢測(cè)板相應(yīng)孔中，37振蕩造就1h；每孔參加1l幫助噬菌體K13，37振蕩造就1h。離心棄上清，每孔加200l2YT-AK，造就留宿，離心，上清即外貌表達(dá)有交融抗體的單克隆噬菌體，4保存。(2)單克隆噬菌體與HSP70

6、結(jié)合的ELISA檢測(cè)抗原HSP70包被酶標(biāo)板操縱同上，向每孔加50l單克隆噬菌體抗體上清液，2%PBS洗滌后，參加二抗HRP-anti-13；陽(yáng)性比擬為一抗鼠抗人HSP70，二抗兔抗鼠lgG；陰性比擬僅參加2%PBS。以TB為底物,2硫酸停頓反響,取經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)D405D630的均勻值，以D值大于陰性比擬均勻值的2倍,斷定為陽(yáng)性。2效果21低級(jí)噬菌體抗體庫(kù)滴度含重組噬菌粒的庫(kù)容為1.21012的抗體庫(kù)經(jīng)K13幫助噬菌體幫助熏染后，得到表達(dá)交融抗體的低級(jí)噬菌體抗體庫(kù)，滴度為4.21016pfu/l。2.2噬菌體淘洗產(chǎn)率以純化的肺癌相干卵白HSP70為抗原舉行了四輪“吸附洗脫擴(kuò)增的挑選，洗脫的噬菌

7、體產(chǎn)率表現(xiàn)第四輪與第三輪的接納率相近,說(shuō)明顛末挑選后陽(yáng)性克隆已得到富集,見表1。表1各輪挑選歷程中噬菌體的接納率挑選次數(shù)投入量產(chǎn)出量接納率%14.210138.01021.910-922.410132.01058.310-733.010134.21061.410-544.010137.21061.810-5注：接納率(%)=投入噬菌體量/產(chǎn)出噬菌體量100%2.3單克隆噬菌體抗體與HSP70結(jié)合的ELISA檢測(cè)效果從四輪中每輪隨機(jī)挑取12個(gè)單細(xì)菌克隆制備噬菌體交融抗體，與包被的HSP70抗原反響經(jīng)ELISA檢測(cè)，共得到5個(gè)陽(yáng)性克隆第一輪0個(gè)，第二輪1，第三輪1個(gè)，第四輪3個(gè)。2.4陽(yáng)性克隆菌的

8、質(zhì)粒PR斷定效果5個(gè)陽(yáng)性菌經(jīng)質(zhì)粒提取后行PR擴(kuò)增,經(jīng)凝膠電泳,可見只有1個(gè)克隆片斷為800bp擺布,切合抗體片斷的理論值,見圖1。2.5單鏈抗體DNA序列闡發(fā)效果將挑選出的1個(gè)單克隆菌交上?；瞪锕窘蛹{通用引物L(fēng)B3測(cè)序,所得序列在GeneBank中舉行比擬,結(jié)圖1質(zhì)粒PR電泳斷定圖果表白該克隆含有人類免疫球卵白同源序列,測(cè)序效果(VH+Linker+VL)如下,下劃線部門為L(zhǎng)inker。3討論近幾年來(lái)隨著更多腫瘤相干抗原的創(chuàng)造，基因工程抗體技能的日漸美滿，新一輪以抗體為導(dǎo)向的腫瘤治療又開始備受存眷3。20世紀(jì)90年代初,人們將噬菌體展示技能應(yīng)用于抗體克隆和表達(dá),使抗體的制備技能產(chǎn)生打破性

9、的希望4，5，與傳統(tǒng)的雜交瘤技能比擬,噬菌體展示技能挑選容量大，輕便，易于舉行抗體的改革，而且不需經(jīng)免疫即可大量制備抗體，因此在腫瘤的診斷和治療，腫瘤疫苗研制方面應(yīng)用遠(yuǎn)景遼闊6。HSP70在許多人類腫瘤構(gòu)造細(xì)胞中均有較高的表達(dá)，腫瘤泉源的HSP70誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫是當(dāng)前研究的熱門。以往的研究表白2，7，HSP70引發(fā)有用抗腫瘤免疫效應(yīng)的抗原性泉源于它所結(jié)合的多肽，而不是HSP70自己。但是，按照腫瘤細(xì)胞的HSP70特異表達(dá)于細(xì)胞外貌，而正常細(xì)胞那么是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的特性，作者推測(cè)，可以使用該特性，制備腫瘤源性的HSP70抗體，使HSP70可作為腫瘤相干抗原而不是僅僅作為“腫瘤抗原載體大概“免疫佐劑來(lái)誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫，成為以HSP70為底子的腫瘤靶向治療的另一個(gè)切入點(diǎn)。本研究作為先期研究事情，以肺癌構(gòu)造中純化出的具有抗原活性的HSP70作為抗原，從人源性肺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)中挑選HSP70抗體，經(jīng)四輪挑選，得到富集后的噬菌體抗體庫(kù)。從四輪隨機(jī)挑取的48個(gè)菌落中，經(jīng)單克隆噬菌體抗體與HSP70結(jié)合的ELISA檢測(cè)出中斷定5個(gè)含單鏈交融抗體的陽(yáng)性克隆，經(jīng)隨后的PR斷定，在1株陽(yáng)性克隆中得到與理論值同