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文檔簡介

1、基因型鑒定protocol一、基因型鑒定protocol1、剪尾取樣及編號從鼠房取出需要基因型鑒定的小鼠（由于小鼠一般在21天時已經(jīng)斷奶，故小鼠剪尾的時間應(yīng)不小于三周），查看鼠箱上的基因信息，根據(jù)基因信息從編號筆記本上找出相應(yīng)編號，續(xù)編。在EP管上預(yù)先寫明小鼠編號從鼠箱中取出老鼠（戴上手套后用手抓住小鼠尾部向上提出，提住鼠尾不放，將小鼠慢慢放至實驗臺上，此時小鼠會向前爬動，用另一只手從背側(cè)捏住小鼠背部皮膚，要注意捏的位置盡量靠近頸的上部，防止小鼠的頭部扭動），從小鼠尾端用剪刀剪下3mn左右鼠尾（不可超過5mm會使小鼠受傷），將剪下的樣品放入對應(yīng)編號的EP管內(nèi)，用電烙鐵燙及小鼠尾部剪口處，一定要

2、使傷口燙合，防止其流血不止。然后對小鼠進行鼠耳編號。（注意：編號時要記錄小鼠的性別）2、DNA提取向每只含樣品的EP管內(nèi)加入400微升消化液（含蛋白酶K）,將其置于混合儀上消化，55C（此溫度下DNA在水中的溶解度最高，即最為穩(wěn)定），3h。向消化后的樣品中加入400微升異丙醇，反復(fù)顛倒，一般可見絮狀分層（個別樣品看不到）。之后放至離心機13000r,10min。去上清，加入750微升70沱醇，13000r,10min。重復(fù)此操作一次。去上清，將EP管倒置于吸水紙上或置于空氣中晾干。（最好晾干，倒置在吸水紙上有可能會使一部分DNA流失）3、PCR例，三轉(zhuǎn)小鼠，做三次PCR每次PCR十對的基因不同

3、，所用引物不同，每次PCR做樣品數(shù)+3（空對照：不加模板；正對照：突變型小鼠的樣品；負對照：野生型小鼠的樣品）個體系）。單個體系如下：TOCo1-5hzddW1810*buffer（含Mg+）2.5dNTP（2.5mM）2.5PrimerR（20側(cè)）0.25PrimerF（20側(cè)）0.25Taq酶0.5Template1程序：94C預(yù)熱4min94C變性1min61C退火1min30個循環(huán)72C延伸1min72C7min4Chold注意蓋子蓋緊。4、瓊脂糖電泳配膠，根據(jù)規(guī)格來配，如80ml規(guī)格，稱量0.8000g瓊脂糖，加入80ml0.5*TBEbuffer。加熱至沸騰(80ml90s;40ml90s;20ml30s),待冷卻至60C時加0.001%的EB.倒至插有梳子的膠板上，待用。上樣6*loading

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