10種細(xì)胞損傷模型建立方法

1、10種細(xì)胞損傷模型建立方法轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園發(fā)布日期：2012-10-09 14:36文章來源：丁香園分享到：收藏夾新浪微博騰訊微博開心網(wǎng)豆瓣社區(qū)人人網(wǎng)母 E51關(guān)鍵詞：細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)專題義翹神州丁香園丁香通點擊次數(shù)：997現(xiàn)在很多實驗都涉及到細(xì)胞損傷模型的建立和運用，如CC14誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型（體內(nèi)、體外）、PC12細(xì)胞的NO和淀粉樣蛋白（AB）損傷模型、神經(jīng)元 缺血再灌注損傷模型，以及脈絡(luò)寧對骨骼肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用等。一、體外肝細(xì)胞損傷模型建立（CC14和H2O2）1大鼠肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 大鼠4%戊巴比妥麻醉，門靜脈插管，先以無鈣灌流液灌流，繼以37C通入02的IV型膠原酶灌

2、流液繼續(xù)循環(huán)灌流15 min。 將肝臟移至一平皿內(nèi)，輕輕撕去肝包膜后，加入含5%小牛血清的清洗液，用吸管吹打成單個肝細(xì)胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾，低速離心（500 rmin-1，min，4）棄上清，同法用清洗液反復(fù)洗3次。然后用完全1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10%小牛血清，105 UL1青霉素，100 mgL-1鏈霉素和10 mgL-1 胰島素）制成1x109個L-1肝細(xì)胞懸液。分離的肝細(xì)胞經(jīng)0.6%臺盼藍(lán)拒染法測得細(xì)胞活力大于90%，高碘酸雪夫反應(yīng)顯示糖原法鑒定99%為肝實質(zhì)細(xì) 胞。將上述肝細(xì)胞懸液分別加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培養(yǎng)板中，置37C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

3、。1216 h后可見肝細(xì)胞貼壁于培 養(yǎng)板孔底上生長。CC14誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死性損傷模型的建立 肝細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，吸棄上清，更換培養(yǎng)液并加入不同濃度的CC14（116 mmol-L-1），以少量的二 甲亞颯助溶，二甲亞颯終濃度為0.1% （體積分?jǐn)?shù)），作用不同時間（112 h）后，收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測AST，以及肝細(xì)胞的MDA含量和GSHpx 活性；同步測定96孔板中培養(yǎng)肝細(xì)胞的MTT反應(yīng)。根據(jù)檢測結(jié)果制備CC14誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的量效和時效曲線。選擇最造損傷濃度和損傷時間制備肝細(xì)胞 的損傷模型，同時設(shè)溶媒對照組，每組至少設(shè)3個復(fù)孔。H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死性損傷模型的建立 同法更換培養(yǎng)液，

4、加入不同濃度的H2O2 （0.23.2 mmol-L-1），作用不同時間（0.54 h）后，收集 24孔板中培養(yǎng)上清檢測ALT，測定肝細(xì)胞的MDA含量；同步測定96孔板中培養(yǎng)肝細(xì)胞的MTT反應(yīng)。根據(jù)檢測結(jié)果制備H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的量效和 時效曲線，選擇最適損傷濃度和損傷時間制備肝細(xì)胞的損傷模型，同時設(shè)溶媒對照組，每組至少設(shè)3個復(fù)孔。4檢測指標(biāo)（1） AST、ALT的測定 培養(yǎng)的肝細(xì)胞經(jīng)離心（1 800 r-min-1，10 min）后收集上清，按試劑盒說明書步驟測定上清液中AST和（或）ALT活性，結(jié) 果以U（106 cell）-1表示。（2）肝細(xì)胞增殖試驗采用MTT比色法。（3） 肝細(xì)胞

5、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHpx）活性的測定 先制備GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線。棄肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入0.2% Triton-100水溶液0.5 ml，混勻， 2 min后，離心（2 500 r-min-1，10 min），取上清液（肝細(xì)胞樣品）0.4 ml，另設(shè)樣品空白管，非酶反應(yīng)管和試劑空白管，加入各種試劑?；靹蚝罅?即計時，靜置12 min后，以樣品空白管調(diào)零點，于423 nm波長處讀得吸光度（A）值。在GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的GSH波度。GSHpx酶活力單位 是在37C，pH6.5條件下，每106個肝細(xì)胞、每分鐘使GSH濃度下降1 pmol為1個酶活力單位。計算公式為：GSHpx活力單位=（GSH

6、非酶管-GSH樣品管-GSH試劑空白管）/3。結(jié)果以U（106 cell）-1表示。（4 ）肝細(xì)胞丙二醛（MDA）含量的測定 先制備MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線。棄肝細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入生理鹽水1 ml，混勻，移入離心管中，離心（2 500 rmin-1，10 min)，棄上清，加15% TCA 2 ml,破壞細(xì)胞并沉淀蛋白質(zhì)，加入0.67% TBA 2 ml,于沸水浴中加熱30 min。根據(jù)樣本的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的濃度，結(jié)果以nmol(106 cell)-1表示。(5)數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以士s表示，計量資料組間比較采用t檢驗。兩變量間相互關(guān)系，采用直線相關(guān)和回歸分析。二、體內(nèi)肝損傷模型(酒精)1、材

7、料 純系SD雄性大鼠，體重180g200 g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。食用酒精選用北京釀酒總廠出品的56度紅星二鍋頭。2、方法 將大鼠隨機分成5組，飼養(yǎng)在23C25C室內(nèi)，自由進(jìn)食、進(jìn)水；根據(jù)大鼠體重，A、B、C、D組每日用56紅星二鍋頭白酒以10ml/1Kg分 別灌胃0、4周、8周和12周；E組于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠通過股動脈采血處死，收集血漿和肝臟標(biāo)本。3、主要指標(biāo)檢測肝功能：應(yīng)用日立7170自動生化分析儀測定總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST) 等。氧化抗氧化物質(zhì)測定：采用南京建成生物工程研

8、究所提供的試劑盒分別檢測丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超 氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。大鼠肝臟病理檢查：大鼠處死后立即取出肝臟，稱重后一部分以10%的福爾馬林液固定作病理，作常規(guī)石蠟切塊并HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀 察，用半定量法分別判定脂肪變性、及酒精性肝炎炎癥活動度三、四氯化碳體外損傷肝細(xì)胞模型原代培養(yǎng)的正常大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)24h (貼壁良好)后，置培養(yǎng)皿于一密閉的塑料盒，內(nèi)置四氯化碳0.4M容積，37度90min，造成肝細(xì)胞損傷的模型，后 轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)，進(jìn)行下一步實驗。(即熏蒸法)肝細(xì)胞培養(yǎng)12h后，吸棄上清，更換培

9、養(yǎng)液并加入CCL4 8mM (事先用DMSO溶解，DMSO終濃度1%)，作用6h后收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測AST 以及肝細(xì)胞MDA含量盒GSHpx活性，評價損傷程度。(常用方法)四、醋氨酚體外損傷肝細(xì)胞模型肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后，用清洗液洗2次，培養(yǎng)液洗1次，然后換以20mM醋氨酚的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12h，取培養(yǎng)液，進(jìn)行下一步實驗。五、過氧化氫體外損傷肝細(xì)胞模型肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸棄上清液，更換培養(yǎng)液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培養(yǎng)上清液檢測AST活性和MDA含量。六、氤化鉀缺氧肝細(xì)胞損傷模型肝細(xì)胞培養(yǎng)24h后，貼壁生長良好的肝細(xì)胞中加入氤化鉀2.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)2

10、h，定量檢測培養(yǎng)液上清中LDH活性，以及酶的活性反應(yīng)肝細(xì)胞損傷程度。 本模型可以更好的模擬缺氧損傷。七、硫代乙酰胺(TTA)體外肝細(xì)胞損傷模型肝細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24h后，貼壁生長良好的肝細(xì)胞中加入TTA0.18mM，繼續(xù)培養(yǎng)48h，肝細(xì)胞大量損傷和壞死，上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活性升高，造 成體外損傷肝細(xì)胞模型。八、內(nèi)毒素體外損傷肝細(xì)胞模型貼壁生長良好的肝細(xì)胞中加入內(nèi)毒素70uL/mL，置37度，5%CO2培養(yǎng)此時上清LDH活性升高造成肝細(xì)胞損傷模型，造成體外肝細(xì)胞損傷模型。九、半乳糖胺(GalN)體外損傷模型分離肝細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)12-24h后，待細(xì)胞貼壁生長均勻后，加入5mMGalN的肝細(xì)胞培養(yǎng)

11、液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，測定培養(yǎng)上清液中ALT，ALT顯著升高時， 肝細(xì)胞造模成功。十、帕金森體外模型體外培養(yǎng)的中腦多巴胺能神經(jīng)元MPTP損傷模型l實驗操作：實驗采用胚胎齡14 一 16天的大鼠，剖子宮取胎，取胎鼠中腦腹側(cè)區(qū)?？蓪⒍鄠€胚胎來源的組織收集在一起，置Fl2培養(yǎng)基(Gibco)至35mm 的培養(yǎng)皿中，以細(xì)剪刀剪碎。將2ml含0.125%的胰酶的F12加入到組織中，該混合物于37C孵育10分鐘后，加入DNase I (Sigma)至終濃度80ng /m1，繼續(xù)于37oC孵育10分鐘。消化后的組織以尖端被火拋光的移液管輕輕吹打8次。該細(xì)胞懸液以種植培養(yǎng)基稀釋(種植培養(yǎng)基：MEM，補充以 2

12、mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mg/ml谷胱甘肽，10 units/ml青霉素，10ul/ml鏈霉素和7.5%胎牛血清)。細(xì)胞然后種植于35mm的預(yù)先以 10ug/m1 po1y1ysine (Sigma) 和 2.5ug / ml merosin (Chemicon)鋪底的培養(yǎng)皿中，種植密度為 50,000 細(xì)胞 /cm2。培養(yǎng) 16 小時后，培養(yǎng) 基換為無血清培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基為F12和basalEagles medi um，補充以33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，15 mM碳酸氫鈉，10mM HEPES(pH7.0)， 1ug/ ml谷胱甘肽，20ug/ml胰島素，100ug/ml轉(zhuǎn)鐵

13、蛋白，60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亞硒酸鈉(NaSe)，30nM三碘甲狀腺原氨酸，0.5 unit/ml 青霉素和0.5mg/ml鏈霉素。毒物處理：于第4天以1uMMP+處理48小時。然后進(jìn)行分析。模型評價：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞計數(shù)、免疫組化檢測TH陽性細(xì)胞的數(shù)目和形態(tài)。體外培養(yǎng)的中腦多巴胺能神經(jīng)元6-OHDA損傷模型采用上述方法選擇胎鼠，分離中腦腹側(cè)部，解剖顯微鏡下仔細(xì)剔除腦膜和血管，用高糖T-BSS反復(fù)沖洗滌之七遍。并將組織剪碎，移入0.25%胰蛋白酶溶 液中，37oC振蕩消化30分鐘，后加入血清數(shù)滴終止消化，用吸管輕輕吹打后，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液混勻，1000rpm，10min離心收集細(xì)胞， 反復(fù)2次，后加入含血清的完全DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，過220目不銹鋼篩網(wǎng)使成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后將約3x106個細(xì)胞接種人事先涂有多聚賴