第5講目的基因的克隆與分離

1、生物技術(shù)的核心課程Principles of Genetic Engineering基 因 工 程 原 理生命學(xué)院遺傳基因工程教研室 余麗蕓 教授博士基因工程原理綱要第一講 基因工程概論第二講 基因工程的主要技術(shù)第三講 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第四講 基因克隆的載體與受體第五講 目的基因的克隆與分離第六講 克隆基因的檢測(cè)與功能鑒定第七講 克隆基因的表達(dá)與產(chǎn)物純化第八講 基因表達(dá)的調(diào)控目的基因：準(zhǔn)備要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。1. 優(yōu)點(diǎn)2. 缺點(diǎn)目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。目的基

2、因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene二、隨機(jī)片斷化1. 限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開。 內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個(gè)切點(diǎn)。2）6bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個(gè)切點(diǎn)。隨機(jī)程度高。如Hae、AluI、Sau3A。 內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連。（Sau3ABamH I）2. 機(jī)械切割法（1）超聲波超聲波強(qiáng)烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷。（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片

3、斷。1976年H.G. Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第二節(jié) 化學(xué)合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動(dòng)化合成法。 保護(hù)dNTP的5端P 或3端-OH 用酸或堿的脫保護(hù)（1）原理1. 磷酸二酯法 帶保護(hù)的單核苷酸連接保證合成反應(yīng)的定向進(jìn)行。帶5保護(hù)的單核苷酸與帶3保護(hù)的另一個(gè)單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。（2）合成過程下一個(gè)5端保護(hù)的單核苷酸又可以同3端保護(hù)的二核苷酸聚合。原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應(yīng)的單核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先連接

4、了一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。2. 磷酸三酯法將第一個(gè)核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。 固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸連接處有三個(gè)酯鍵！固相磷酸三酯合成過程固相支持物結(jié)果是全保護(hù)的DNA：5 DMT, 3固相支持物, 核苷酸之間對(duì)氯苯。最后脫保護(hù)固相 支持物固相 支持物C化學(xué)合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。 二、 化學(xué)合成DNA片斷的組裝用T4多核苷酸激酶使各個(gè)片段的5端帶上磷酸。1. 互補(bǔ)連接法預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片斷之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。（2）5端磷酸化（1）互補(bǔ)配對(duì)（合成的DNA單鏈的5端是-OH）T4 DNA連接酶T4多核苷酸激

5、酶使5-OH磷酸化完整的DNA雙鏈（3）連接酶連成完整雙鏈2. 互補(bǔ)延伸連接法預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以相互作為另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。3 5 5 3 5 3 T4DNA連接酶Klenow片段引物1. 直接合成基因三、 寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)2. 合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA 3. 合成探針序列4. 定點(diǎn)突變合成合成帶有定點(diǎn)突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學(xué)合成費(fèi)用較低DNA合成儀5. 合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點(diǎn)人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinke

6、rAdaptor 將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。 理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫(kù)。一、基因文庫(kù)的構(gòu)建1. 基因文庫(kù)（gene library）第三節(jié) 目的基因的保存與文庫(kù)構(gòu)建（2）目前常用的載體 2. 構(gòu)建基因文庫(kù)的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對(duì)載體的要求載體系列： 容量為 24 kp cosmid載體： 容量為 50 kb YAC： 容量為 1 M

7、b BAC: 容量為 300 kb斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3. 基因文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。 物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷。 酶切法：（2）載體與基因組DNA大片段的連接 粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamH I的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末

8、端轉(zhuǎn)移酶粘性末端 同聚物加尾4. 基因組文庫(kù)的大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f: 插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因 組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）例如：人的基因組是 3109 bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)= 4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61Gf=4.6131091.7104= 8.11051. cDNA以mR

9、NA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2. cDNA library二、 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNAcDNA3 3 5 5 反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫(kù)。4. 構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（1）總RNA（total RNA）提取3. cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。 mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化 原理 mRN

10、A的分離純化Column（柱）反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成 cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。 用Oligo dT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物用堿處理或用RNase H降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3 3 5 5 引物cDNA第一鏈3 5 引物 降解mRNA模板或RNaseH堿剩下的cDNA單鏈的3末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈

11、DNA。cDNA第一鏈5 cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5 3 cDNA第二鏈合成去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。DNA第一鏈cDNA第二鏈5 3 cDNA第一鏈cDNA第二鏈5 3 5 3 這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNA Pol I除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。mRNAcDNA3 5 反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3 5 引物mRNAcDNA第一鏈3 5 mRNAmRNA

12、DNA 聚合酶DNA 聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3 5 RNaseHDNA ligase去引物在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。 或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。5. cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶6. cDNA文庫(kù)的大小一個(gè)cDNA文庫(kù)要包含99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-p)ln (1- )p: 文庫(kù)包含了完整mRNA的概率（99%）: 某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n三、文庫(kù)的查詢（scree

13、ning）用目的基因探針與文庫(kù)中的重組載體進(jìn)行Southern blot雜交。文庫(kù)載體探針電泳后雜交放射自顯影測(cè)序分析第四節(jié) 目的基因的分離和擴(kuò)增一、目的基因的分離1. 探針柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNATotal mRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR2. mRNA消解雜交原理：羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈D

14、NA。（Hydroxylapatite column）從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。 將表達(dá)A蛋白的組織mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。 不能雜交的cDNA就包括特異表達(dá)的A基因的cDNA單鏈。 用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A 的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BAPCRcDNA文庫(kù)mRNA differential displ

15、ay RT-PCR原理：利用幾乎所有mRNA3的polyA尾巴合成poly T 的錨定引物 ，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的第一鏈，然后加入隨機(jī)引物合成第二鏈，得到與mRNA對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽，變性膠電泳，比較不同來源的cDNA帶，有差異的基因進(jìn)一步克隆。（1）3端的錨定引物Oligo(dT)引物的3端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)第二個(gè)不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTTM：A、G or C N: A、G、T or C5 3 （2）12種錨定引物AG TTTTTTTT5 3 CG TTTTTTTT5 3 GG TTTTTTTT5 3 TG TTTTTTTT5 3 AA TTT

16、TTTTT5 3 CA TTTTTTTT5 3 GA TTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 AC TTTTTTTT5 3 CC TTTTTTTT5 3 GC TTTTTTTT5 3 TC TTTTTTTT5 3 （3）5端的隨機(jī)引物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTT5 3 擴(kuò)增cDNA第一鏈。RTNM TTTTTTTT 5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二鏈，并PCR（4）隨機(jī)引物與錨定引物成對(duì)擴(kuò)增12種錨定引物，若與20種隨機(jī)引物，可組成240組引物。引物組合：240組能分出2

17、0000多條帶！實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如果每條帶相當(dāng)于一種mRNA，20000 mRNA基本上反映了一種特定細(xì)胞中全部的mRNA。在測(cè)序膠上，每組擴(kuò)出50-100條長(zhǎng)度為100-500bp的帶。（5）隨機(jī)-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測(cè)序膠中電泳。選擇有差異的帶，進(jìn)一步PCR作探針。篩選文庫(kù)，找到差別基因的全長(zhǎng)序列。二、PCR擴(kuò)增獲得目的基因1. 直接從基因組中擴(kuò)增（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增真核生物基因組含有內(nèi)含子！適合擴(kuò)增原核生物基因。原核基因組部分原核細(xì)胞提取基因組DNAPCR擴(kuò)增（1）提取基因組 total RNA

18、（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴(kuò)增（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物2. 從mRNA中擴(kuò)增: RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴(kuò)增真核生物基因。目的基因 的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因 的引物2目的 基因cDNA第二鏈PCRmRNA克隆外源基因外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5端磷酸與3-OH連到一起。第五節(jié) DNA片段的體外連接1. 兩段DNA的連接依靠粘性末端2. DNA片斷與載體的連接依靠粘性末端ligasenick二、齊平末

19、端（blunt end）的連接5端與3端并列靠近的時(shí)間太短，不容易被連接酶連接。1. 直接連接T4 DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 1972年，斯坦福大學(xué)的P. Labban和P. Kaiser提出。（1）同聚加尾法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3-OH端加上脫氧核苷酸。原理：分別給載體和插入片斷加上互補(bǔ)的核苷酸。加尾堿基互補(bǔ)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能把任何片段連接起來不能把插入片段再切下來。非酶切位點(diǎn)用T4 DNA連

20、接酶連到平端DNA上，然后再用酶切，形成一個(gè)人工粘性末端。（2）銜接物(linker)連接 linker用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列的平端雙鏈。GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker： linker的作用 缺點(diǎn)：1）可以用內(nèi)切酶把插入片段切下來。如果插入片段內(nèi)部也有該酶位點(diǎn)，不能切下完整的插入片段2）能給載體連接上Polylinker: 優(yōu)點(diǎn)：DNA接頭 (adapter)連接法1978年康內(nèi)爾大學(xué)的吳瑞教授發(fā)明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用T4DNA連接酶連到DNA分子的兩端，直接成為

21、人工粘性末端。 adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點(diǎn)序列）。 adapter的作用Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接頭自我連接接頭與接頭會(huì)彼此以粘性末端接在一起，影響與DNA片段的連接。優(yōu)點(diǎn)：連上后就能用。缺點(diǎn)：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5端的磷酸，防止自我連接。 （以

22、后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）防止自我連接5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接頭之間不能形成磷酸二酯鍵自我連接！ 5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP處理-OHHO-Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG- HO-GGCC CCGG-OH -GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5

23、缺口缺口HO-OHCIP處理T4 ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接。三、PCR產(chǎn)物的連接1. 在引物的5端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)符合載體的多克隆位點(diǎn)；（1）設(shè)計(jì)原則（2）帶酶切位點(diǎn)的引物的結(jié)構(gòu)3端1520bp與模板互補(bǔ)； 5端610bp是某個(gè)內(nèi)切酶的識(shí)別序列。（5端多余的35bp屬保護(hù)堿基）避免與所擴(kuò)增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點(diǎn)重復(fù)。引物1GCAGAATTC 互補(bǔ)序列模板EcoR I位點(diǎn)5-3 GCAGAATTC 互補(bǔ)序列5-3 3 模板GCAGAATTC 互補(bǔ)序列 PCR產(chǎn)物5-3 3 復(fù)性延伸模板模板3 3 GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列模板BamH I 位點(diǎn)-5 3- 5 復(fù)性延伸模板

24、模板3 3 GCTAGCCGG 互補(bǔ)序列-5 3-模板5 GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物 互補(bǔ)序列-5 3-引物2帶酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC PCR產(chǎn)物5-3 GCTAGCCGG PCR產(chǎn)物-5 3- CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoR I位點(diǎn)BamH I位點(diǎn)AATTC PCR產(chǎn)物5-3 GCTAG PCR產(chǎn)物-5 3- GCEcoR IBamH I兩頭各有一個(gè)粘性末端！2. 與T載體直接連接（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3端一般都有一個(gè)ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA雙鏈的3端再加上一個(gè)多余的核苷酸（優(yōu)先加A）。（2）T載體的兩個(gè)3端人為地各加一個(gè)T利用Taq DNA聚合

25、酶，當(dāng)原料中只有dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加T！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA四、DNA體外連接應(yīng)注意的事項(xiàng)插入片斷與載體的酶切位點(diǎn)互補(bǔ)相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進(jìn)行非粘性末端連接。EcoR IEcoR IEcoR I（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamH I、Bcl I、Bgl II、Sau3A I、Xho II都產(chǎn)生GATC4個(gè)堿基的粘性末端。2. DNA插入的方向正確用雙酶切由于產(chǎn)生的粘性末端不同，只能以固定方向連接。EcoR IBamH IEcoR IBamH IEcoR IBamH I3. 插入基因的開放閱讀框（

26、ORF）正確（1）DNA定向插入（2）起始密碼尤其當(dāng)載體上有ATG起始密碼的時(shí)候，更要注意。ATGGAATTC載體ATGCGGAATTCT插入片斷EcoR IEcoR IATGGAATTC T重組但移碼突變！4. 防止載體自身環(huán)化連接（1）提高插入片斷的用量連接反應(yīng)體系中，插入片斷比載體多10倍以上。（2）用堿性磷酸酶處理載體載體切口的5磷酸被除去，不能自我連接。但可以與插入片斷以單鏈連接。5 3 載體插入片斷1. 載體自身環(huán)化連接（能存活）2. 載體之間互相連接（能存活）3. 插入片段互相連接（不能存活）4. 一個(gè)載體與幾個(gè)插入片段重組（能存活）五、載體和外源DNA插入片段的連接結(jié)果5. 幾

27、個(gè)載體與一個(gè)插入片段重組（能存活）1. 目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。第六節(jié) 重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞一、感受態(tài)大腸桿菌的制備使用喪失了限制體系的大腸桿菌。如K12系列的大腸桿菌。2. 菌種用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3. 制備原理4. 制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4On ice 5-10 min4離心收集菌用 冰 冷 的60mM CaCl2重懸4離心收集菌4離心收集菌分裝、-70凍存用 冰 冷 的60mM CaCl2重懸On ice 30 min用 冰 冷 的60mM CaCl2重懸二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒

28、DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。1. 外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的幾種方法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。每g DNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。 3. 轉(zhuǎn)化方法 2. 轉(zhuǎn)化率簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/g DNA）。（1）熱休克法（heat shock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/g DNA）。10ng載體DNA100L感受態(tài)菌 On ice混合，靜置10分鐘42C 1分鐘加入1mL LB培養(yǎng)基37搖1小時(shí)10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0

29、.5-0.6冰浴15分鐘，2離心集菌冰冷的水重懸菌體2離心集菌冰冷的水重懸菌體2離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成 50-300L 電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F 脈沖控制器200-400 0.5g質(zhì)粒DNA On ice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37中速震蕩60分鐘10-100L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化10-100L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37過夜環(huán)形重組質(zhì)粒 質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片斷進(jìn)入細(xì)菌會(huì)被降解。 環(huán)形質(zhì)粒數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌。必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。儲(chǔ)存感受態(tài)菌要在-70以下。CaCl2處理使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化。

30、融化后一般不能再次凍存使用。把重組的噬菌體DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。（1）體外包裝（in vitro packaging） （2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的DNA接受器位點(diǎn)（receptor site)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。cI857基因是個(gè)溫度敏感性阻遏蛋白基因，感染細(xì)菌后，在32下培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)能夠保持溶源性。 但當(dāng)溫度升高到44-45時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致cI基因編碼的阻遏蛋白失活，DNA復(fù)制、外殼蛋白合成。便于提取外殼蛋白。但由于該噬菌體的S基因上有一個(gè)突變，所以細(xì)菌還不裂解。cI857其它基因溶源狀態(tài)（DNA不轉(zhuǎn)錄、不翻譯）DNA阻遏 蛋