如何做好Western-blot(免疫印跡)1

1、如何做好如何做好Western-blot（免疫印跡）（免疫印跡）-隨意談隨意談印記法印記法 印跡（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用探測物特異性檢測未知樣品的方法。 1975年，Southern將DNA轉印到硝酸纖維素（NC）膜上，并利用DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段，后來稱這種方法為Southern印跡法。印記法Southern BlotNorthern BlotWestern BlotFar Western BlotDot BlotDNARNAProteinWestern-blot 高靈敏度、高特異性的蛋白檢測 應用于絕大多數生物、醫(yī)學實驗室 成熟的技術、豐富的

2、方案選擇主要步驟主要步驟樣品制備電泳轉膜封閉結合抗體發(fā)光（顯色）信號檢測樣品制備樣品制備 細胞裂解 蛋白溶解（可一步完成） 蛋白定量細胞裂解細胞裂解 離子型去垢劑（SDS） 非離子型去垢劑（N-P40，TritonX-100） Tris、NaCl、疊氮化鈉、正釩酸鈉等 蛋白酶抑制劑 EDTA、PMSF、PI cocktail等 超聲 研磨 勻漿 反復凍融Laemmli Sample Buff.(161-0737 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 5% b-ME, 25%Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 變性蛋白變性蛋白N

3、ative Sample Buff.(161-0738 30ml)62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 40% Glycerol, 0.01% Bromophenol blue 非變性蛋非變性蛋白白35mm小盤：250ml 30mm中盤：500ml100mm大盤：1ml檢測磷酸化蛋白：再加入檢測磷酸化蛋白：再加入Na3VO4 0.1mM及及NaF 25mM 樣品制備樣品制備緩沖液緩沖液Tricine Sample Buff.(161-0739 30ml)200mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 40% Glycerol, 0.04% Coomassie blu

4、e 多肽多肽蛋白的定量 用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三種方法，其中A280法靈敏度為0.2-2 mg/ml，但核酸可引起強干擾作用；Lowry 法靈敏度為5-100 g/ml，雖相對準確，但干擾物質多且反應速度慢，而且含DTT溶液不宜用此法；Bradford法靈敏度為25-200 g /ml，由于相對干擾物質較少，且反應時間僅需2分鐘,故適合用于大多數研究的蛋白定量。 Bio-rad另有對一種適用于去垢劑增溶蛋白樣品的比色測定的試劑盒DC Protein Assay Kit，該方法類似于常規(guī)的Lowry方法，但經過改良后，節(jié)省了操作時間。DC蛋白測

5、定只需要15分鐘的溫育時間，而且吸收值讀數保持2小時的穩(wěn)定。RC DC Protein Assay Kit蛋白測定是一種適用于含還原劑和去垢劑的蛋白測定，具有原來DC蛋白測定的特點，并能與更多的試劑兼容，簡化了復雜蛋白樣品溶液的定量測定。特殊的兼容物 - - Detergent Reducer &. Detergent樣品制備樣品制備定量定量 200800 nm Scanning mode Standard curves Kinetics Direct display PrinterSmartSpec plus SpectrophotometerProtein AssayRC DC P

6、rotein Assay Reducing agent compatible Detergent compatible電電 泳泳基質及交聯(lián)劑基質： 丙稀酰胺（Acrylamide）交聯(lián)劑： 基質及交聯(lián)劑 T% C% 蛋白SDS-PAGE常用C：1：29，1：37.5 T%的線性分離范圍：%100)()()(mlgg溶液總體積交聯(lián)劑丙稀酰胺）交聯(lián)劑（丙稀酰胺（）交聯(lián)劑（100gggT線性分離范圍5572127.53694102080121260151043C=1:29非變性體系非變性體系1配方積層膠4 A/B, 0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 0. 1% AP, 0. 04%

7、TEMED分離膠T A/B, 0.625M Tris-HCl, pH 8.8, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液62.5 mM Tris-HCI, pH 6.8, 40% 甘油, 0.01% 溴酚藍電極緩沖液25 mM Tris, 192 mM甘氨酸, pH 8.3變性體系變性體系1配方積層膠4 A/B, 0.125M Tris-HCl pH 6.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分離膠T A/B, 0.625M Tris-HCl pH 8.8, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液62.5 m

8、M Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 25% 甘油,0.01% 溴酚藍電極緩沖液25 mM Tris, 192 mM 甘氨酸, 0.1% SDS, pH 8.3適合小分子蛋白分離的適合小分子蛋白分離的Tris-Tricine 體系體系1配方積層膠4 A/B, 0.745M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED分離膠10 A/B*, 1M Tris-HCl pH 8.45, 0. 1% SDS, 0. 1% AP, 0. 04% TEMED樣品緩沖液200mM Tris-HCI, pH 6.8, 2% SDS, 40% 甘油, 0.0

9、4% 考馬斯亮藍G-250電極緩沖液100mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1% SDS*建議選用C%=2.6%*可將陽極緩沖液換成0.2M Tris, 0.1% SDS預混電泳緩沖液預混電泳緩沖液Premixed Electrophoresis Buffers161-0732 10 x Tris/Glycine/SDS, 1 L161-0772 10 x Tris/Glycine/SDS, 5 L cube161-0734 10 x Tris/Glycine, 1 L161-0771 10 x Tris/Glycine, 5 L cube161-0744 10 x Tri

10、s/Tricine/SDS, 1 LSDS-PAGE主要設備主要設備Precision Plus ProteinTM 蛋白標準品 條帶窄而清晰，分子量準確（經質譜驗證），可用于蛋白分子量測算； 未預染的條帶標記鏈親和素(Streptavidin)親和肽，可進行Western雜交檢測； 包括未預染(161-0363)，預染全藍(161-0373)，雙色(161-0374)和彩染(161-0375) 每種標準品含10個條帶，跨度從10KD250KD。未染標準品分子量測定Fig. 1. Approach for MW determination of an unknown protein. Lane

11、 1, 10 l of Precision Plus Protein unstained standards; lanes 27, a dilution series of an E. coli lysate containing a hypothetically unknown protein (GFP). Proteins were separated by Criterion 420% Tris-HCl gel and stained with Bio-Safe Coomassie stain. Precision Plus ProteinTM 預染標準品預染標準品r20.996轉轉 印

12、印印跡膜 硝酸纖維素硝酸纖維素(NC)膜：歷史悠久，蛋白結合力不強，膜：歷史悠久，蛋白結合力不強，載量較低載量較低Nitrocellulose:載量載量80-100mg/cm2，孔徑，孔徑0.2/0.45 mm 聚偏四氟乙烯聚偏四氟乙烯(PVDF)膜：蛋白結合力強，載量膜：蛋白結合力強，載量較大，使用廣泛較大，使用廣泛Immuno-BlotTM :載量載量150-160mg/cm2，適于反復洗脫?？讖剑m于反復洗脫。孔徑0.2mmSequi-BlotTM ：載量：載量170-200mg/cm2，蛋白結合更牢固，可用，蛋白結合更牢固，可用于蛋白測序或小分子轉印，孔徑于蛋白測序或小分子轉印，孔徑0

13、.2mm 尼龍尼龍(Nylon)膜膜: 帶正電荷，結合力最強，載量最帶正電荷，結合力最強，載量最大，尤其適于很小分子轉印和生物素顯色大，尤其適于很小分子轉印和生物素顯色 Zeta-Probe: 載量載量480mg/cm2，蛋白結合最牢固，封閉只需，蛋白結合最牢固，封閉只需5脫脂奶粉脫脂奶粉緩沖液 Towbin 緩沖液: 25mM Tris, 192mM 甘氨酸, 20% (v/v) 甲醇. Towbin緩沖液+SDS: 25mM Tris, 192mM甘氨酸, 0.1% SDS, 20% (v/v)甲醇. CAPS緩沖液: 10mM CAPS, 10%甲醇. 乙酸緩沖液: 0.7%乙酸不同蛋白

14、須用不同緩沖體系和膜蛋白測序Towbin,CAPSNC,PVDF高分子蛋白Towbin-SDS,CAPSNC,pH!小分子蛋白或肽 Towbin,CAPSNC,PVDF堿性蛋白(pI9)在SDS-PAGECAPS,碳酸-Bjerrum S-NielsenNC,PVDF堿性蛋白(pI9)在native-PAGE0.7% HACNC,PVDF糖蛋白Towbin,CAPS-SDS/-,碳酸鹽, Bjerrum ,S-NielsenNC,PVDF槽式轉印系統(tǒng)（濕轉）槽式轉印系統(tǒng)（濕轉）1.Mini Trans-Blot轉印槽2. Criterion轉印儀3.Trans-Blot 轉印槽4.Trans-

15、Blot Plus轉印槽半干轉印系統(tǒng)半干轉印系統(tǒng)1.Trans-Blot SD 半干轉印槽微量過濾及篩選系統(tǒng)微量過濾及篩選系統(tǒng)1.Bio-Dot 和 Bio-Dot 微量過濾器2.Mini-Protean II多道篩選儀真空轉印系統(tǒng)真空轉印系統(tǒng)1.785 型真空轉印儀 (DNA & RNA 轉印至尼龍膜)轉印設備轉印設備電電 轉轉 印印電轉印+- 電場強度決定轉印的效率電場強度決定轉印的效率 場強越高，轉印越快場強越高，轉印越快 電場強度又取決于電極間距離電場強度又取決于電極間距離 距離越短，場強越高距離越短，場強越高.半干轉印特有的不連續(xù)轉印半干轉印特有的不連續(xù)轉印 緩沖液被隔絕，允

16、許正、負極間緩沖液緩沖液被隔絕，允許正、負極間緩沖液不同不同 陰極陰極(膠面膠面)緩沖液含緩沖液含0.1%SDS，不含甲，不含甲醇，利于轉印醇，利于轉印 陽極陽極(膜面膜面)緩沖液不含緩沖液不含SDS，含，含20甲甲醇，防止轉過醇，防止轉過 配合配合PVDF膜可提高轉膜效率，減少損失膜可提高轉膜效率，減少損失*5儲液：36.34 g Tris, 44.26 g CAPS, 加水至 1 L一個新型不連續(xù)轉膜體系 緩沖液： 1.5mA/cm2 (電壓不超過25V)，轉印30-60min陰極緩沖液陽極緩沖液5Tris-CAPS儲液*20ml20ml10% SDS1ml-Methanol-15mlH2

17、O79ml65ml巧妙的改進，出色的結果 左：10%SDS PAGE后用前述不連續(xù)緩沖體系半干轉印，轉印后印跡膜用考馬斯藍R250染色；中：轉膜后凝膠考染；右：Western Blot檢測該印跡膜上p47蛋白。泳道1、2分別為Kaleidoscope 蛋白標準品和細胞全蛋白 1 2 1 2 216kD132kD特殊轉印要求下儀器和試劑的選擇應用應用轉印緩沖液轉印緩沖液印跡膜印跡膜推薦儀器推薦儀器蛋白測序CAPSPVDF/NC槽式轉印大分子蛋白Towbin with SDS, 不連續(xù)體系PVDF/NC槽式轉印小分子蛋白或多肽Towbin，CAPSPVDF槽式轉印堿性(pI9), 變性膠CAPSN

18、C/PVDF槽式/半干轉印堿性(pI9), 非變性膠0.7% 乙酸NC/PVDF槽式轉印糖蛋白Towbin(with SDS), CAPSNC/PVDF槽式/半干轉印蛋白多糖TowbinNC/PVDF槽式/半干轉印兩種轉印系統(tǒng)的比較半干轉半干轉濕轉濕轉每塊每塊mini膠所膠所需緩沖液的量需緩沖液的量20ml500700ml所需時間所需時間30分鐘分鐘(大分子量蛋大分子量蛋白應適當延長白應適當延長)3060分鐘分鐘(很大分子很大分子量蛋白適當延長量蛋白適當延長)冰浴冰浴不需要不需要需要需要適用范圍適用范圍150KD無限制無限制電壓,電流,功率 設置恒電壓時,電阻下降,電流加大,會產高熱,須降溫(

19、半干除外) 設置恒電流時,電壓和功率隨電阻下降而下降,產熱也會降低,以后隨場強下降,轉印速度也會下降. 設置恒功率時,電流隨電阻下降而升高,升高的速度較恒電壓時低,所以設置恒功率近似恒電流Semi-dry blot Transfer mini gels for 1530 minutes at 1015 V. Large gels can be transferred for 30 minutes to 1 hour at 1525 V. Do not exceed 25 V with this instrument. A current limit (3 mA/cm2 for large ge

20、ls; 5.5 mA/cm2 for mini gels) is recommended to prevent excessive heating during the run.濕轉用Bio-Dot 或 Bio-Dot SF進行斑點或狹縫印跡 直接真空抽濾上樣至印跡膜 方便快速，可高溫消毒，適于高通量篩選轉膜后檢測 麗春紅麗春紅S S染色染色蛋白帶出現后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。 印度墨汁染色印度墨汁染色只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探針的Western印跡過程。 注：染色法不適合蛋白結合力較強的注：染色法不適合蛋白結合力較強的PVDF膜和尼龍膜膜和尼龍膜封閉 目

21、的：封閉膜上多余的蛋白結合位點，減目的：封閉膜上多余的蛋白結合位點，減少非特異性反應少非特異性反應 封閉液封閉液脫脂奶粉或脫脂奶粉或BSA (5) 溶于溶于TBST (100mmol/L Tris-Cl, 9g/L NaCl, 5g/L Tween 20)溶液中溶液中 封閉時間：封閉時間：37一小時，一小時，4過夜過夜常用封閉液試劑膜濃度備注明膠NC1-3%明膠加熱溶解脫脂奶,BLOTTONC,PVDF0.5-5%PVDF所需濃度要高BSANC,PVDF1-5%PVDF所需濃度要高TWEEN20NC0.05-0.3%可能有雜帶一抗、二抗孵育 根據濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉液配制的

22、一抗液與濾膜溫育。37一小時，4 過夜 倒掉一抗溶液，用TBST液濾膜3次，每次5min 加入用封閉液配制的二抗溶液，37一小時，4過夜 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液濾膜3-5次，每次10min。印跡膜檢測全蛋白檢測負離子染色 主要有考馬斯亮藍主要有考馬斯亮藍-R250和氨基黑和氨基黑 優(yōu)點：廉價、快速，缺點：靈敏度優(yōu)點：廉價、快速，缺點：靈敏度低，膜易變形低，膜易變形 氨基黑染色背景較低，脫色容易，氨基黑染色背景較低，脫色容易，優(yōu)于考馬斯藍優(yōu)于考馬斯藍 常用的有Sypro Ruby等 靈敏度高(2-8ng)，線性范圍寬，超過1000倍 可用于蛋白測序等 價格相對昂貴，需要UV成像儀或激光掃描儀全蛋白檢測熒光染色化學發(fā)光底物被HRP或AP分解后發(fā)光，被X光片或成像系統(tǒng)