枯草芽孢桿菌的發(fā)酵

1、枯草芽泡桿菌的發(fā)酵枯草芽泡桿菌的發(fā)醉院業(yè)級名學(xué)專班姓化工學(xué)院 生物工程 生物10-2 姜霞摘要枯草芽抱桿菌是我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的15種菌種之一，其已被越來越多地制成飼用微生態(tài)制劑。因其制劑是無毒、無殘留、無污染的“綠色” 添加劑，故具有廣闊的發(fā)展前景，并已在畜牧業(yè)、飼料業(yè)廣泛應(yīng)用，顯示巨大 的社會效益和生態(tài)效益。通過搖床培養(yǎng)篩選出較適宜于枯草芽抱桿菌發(fā)酵的培 養(yǎng)基配方，發(fā)酵培養(yǎng)基配方確定后，在搖床條件下，通過對溫度、初始pH值、 初始接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速等發(fā)酵條件的摸索，確定最佳發(fā)酵條件。在搖 瓶條件下優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝后，采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對枯草芽 抱桿菌在液體發(fā)酵

2、過程中的菌體數(shù)量、pH值、總糖含量和總氮含量四個(gè)因素 隨時(shí)間的變化進(jìn)行了觀察?？莶菅勘U菌，是芽抱桿菌屬的一種。單個(gè)細(xì)胞 0.70.8X23微米，著 色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽性菌，芽抱0.60.9 X 1.01.5 微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽抱形成后菌體不膨大。菌落表面 粗糙不透明，污白色或微黃色?？莶菅勘U菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、 多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染 的條件致病菌有明顯的抑制作用。枯草芽抱桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造 成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道pH值，間接抑制其它致

3、病菌生長?？莶菅勘U菌菌體自身合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用，能 合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動(dòng)物體內(nèi)干擾素和巨噬 細(xì)胞的活性，在飼料中應(yīng)用廣泛。它還可以用來改善水質(zhì)，應(yīng)用在污水處理和 環(huán)境保護(hù)中。和其它微生物混合使用，還可以用于生物肥料和土地改良等關(guān)鍵詞：枯草芽抱桿菌 生長發(fā)酵活菌數(shù)第一章材料與方法1.1 材料1.1.1 菌種枯草芽抱桿菌1.1.2 培養(yǎng)基(1) LB培養(yǎng)基：蛋白豚10g,酵母膏5g, NaCl10g,蒸儲水1000ml, pH為7, (可溶性淀粉20g)瓊脂20g 0(2)篩選用培養(yǎng)基：含

4、有2%n容性淀粉的LB培養(yǎng)基。(3)種子培養(yǎng)基：豆餅粉 4% 玉米粉3% Na2 HPCO0.8%, (NH4) 2 SO 0.4%,NHC10.15%, H2Q(4)發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉 5.6%,玉米粉 7.2%, Na2HPO0.8%, (NH4) 2 SO0.4%, NHC10.13%, CaCl20.13%, a 淀粉酶 50g。1.1.3 主要試劑蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麥芽糖、酵母浸出物、胰蛋白陳、牛肉膏、 尿素、氯化俊、硫酸鈕、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵、氯化 鈉和氯化鈣。1.1.4 儀器設(shè)備控溫?fù)u床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測定儀、無菌操作臺和紫外分光

5、光度計(jì)。1.2 方法1.2.1 培養(yǎng)基的制備稱量按培養(yǎng)基配比依次準(zhǔn)確地稱取酵母膏、NaCl、蛋白陳放入燒杯中，并在燒杯中加入少量蒸儲水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量， 用熱水溶化后倒入燒杯，也可放在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍 微加熱，酵母膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。溶化可溶性淀粉溶液的配制方法：將所需克數(shù)的可溶性淀粉放入一個(gè)小燒杯中， 加入少量蒸儲水，攪拌成糊狀，然后將糊狀溶液均勻倒入少于培養(yǎng)基總體積的 沸水中，一邊攪拌一邊加熱，待其溶化成透明狀后繼續(xù)在電爐上加熱5分即制成可溶性淀粉溶液。如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將已準(zhǔn)備好的可溶性淀粉溶液倒入燒杯中，將稱

6、 好的瓊脂放入已溶的藥品中，再加熱溶化，補(bǔ)水到所需的總體積。在制備用三 角瓶盛固體培養(yǎng)基時(shí)，一般也可先將一定量的液體培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，然 后按2%勺量將瓊脂直接分別加入各三角瓶中，不必加熱溶化，而是滅菌和加熱 溶化同步進(jìn)行，節(jié)省時(shí)間。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)， 需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時(shí)，不能用銅或鐵鍋加熱溶化， 以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長。調(diào)pH培養(yǎng)基配好以后，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸，用滴 管向培養(yǎng)基中逐滴加1mol/LNaOH邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測其pH,直 至1J pH達(dá)7為止；反之，用1m

7、ol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。對于有些要求pH較精細(xì)的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行。注意：pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度，配制 pH 低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，若預(yù)先調(diào)好 pH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝 周，因此應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整pK分裝按照實(shí)驗(yàn)要求，可將配置的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶中。液體分裝：分裝的高度以試管高度的 1/4左右為直；分裝三角瓶的量則根據(jù)需 要而定，一般以不超過三角瓶的一半為宜。固體分裝：分裝于試管中的應(yīng)不超過試管的 1/5,滅菌后制成斜面；分裝三 角瓶的量以不超過一半為宜。(5)加塞培養(yǎng)基分裝

8、完畢后，在試管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基 內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。(6)包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌 時(shí)冷凝水潤濕棉塞，外邊再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱，組別， 配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)扎好，使用時(shí)容易解開， 同樣注明。滅菌將配置好且包扎完畢的固體、液體培養(yǎng)基及本實(shí)驗(yàn)涉及的試管、三角瓶等及400ml純水于高壓滅菌器中以0.14Mpa, 121c條件下高壓蒸汽滅菌 20分鐘。 (8)斜面擱置將培養(yǎng)基冷卻至50c左右時(shí)放置斜面，斜面在試管的 1/2處為宜，待斜面 凝固后，放置于冰箱中待用。1.2

9、.2 菌種的篩選與保藏(1)倒平板將實(shí)驗(yàn)配制好的培養(yǎng)基加熱溶化，待冷卻至 5560C時(shí)，倒平板9皿。稀釋用接種環(huán)取菌種，放入盛90ml無菌水的三角瓶中，振搖。用一支 1ml無菌 吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管 從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推 制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的菌液。劃線將平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5、10-6三種稀釋度(共三組)然后 用接種環(huán)分別沾取濃度為10-4、10-5、10-6稀釋液并對號在相應(yīng)平板上劃線，室 溫下靜止510min,使菌

10、液吸附進(jìn)培養(yǎng)基。培養(yǎng)將培養(yǎng)基平板倒置于37c的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)23天，觀察淀粉圈。對有淀 粉圈的菌落，測量淀粉圈的直徑 D,菌落直徑中,計(jì)算d的比值，可進(jìn)行拍照， 選擇淀粉圈較大的菌落作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌種。(5)接種接種到斜面培養(yǎng)基中，標(biāo)注上日期等信息。放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為一級種子。(6)保藏斜面置于37c的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)23天，觀察菌種長勢好壞，若菌種長勢 好則將其放入冰箱中保藏，若長勢不好則需多次斜面轉(zhuǎn)接。1.2.3 枯草芽抱桿菌生長曲線測定取12切曲如；用記字筋拐標(biāo)明的削間即12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 和 23h。接種用1ml無菌吸管吸取2ml枯草芽

11、抱桿菌培養(yǎng)液（培養(yǎng)1012h）轉(zhuǎn)入盛有100mlLB 液的三角瓶內(nèi)，混合均勻。培養(yǎng)將已接種的三角瓶放置37c振蕩培養(yǎng)（振蕩頻率為100r/min ）分別在培養(yǎng)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 和23h時(shí)，用無菌吸管吸取1ml菌液放入標(biāo)有相應(yīng)時(shí)間的無菌試管中，立即放入冰箱中儲存，最后一同比濁測定光密度 值。比濁測定用無菌水作空白對照，選用660nm波長進(jìn)行光電比濁測定，從早取出的培養(yǎng)液開始依次測定，對細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用無菌水適當(dāng)稀釋后，使其光密度值在 0.10.65之內(nèi)的生長情況。菌體進(jìn)入對數(shù)生長期即可作為二級種子液用于分批 培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。（測定PH值前，將待測

12、定的培養(yǎng)液震蕩，使細(xì)胞均勻分布）。PH值測定結(jié)果培療時(shí)間（h）12345678PH值6.56.76.97.17.37.06.86.41.2.4 菌種搖瓶培養(yǎng)(1)稱量 根據(jù)需要量計(jì)算并依此稱取豆餅粉、 玉米粉、Na? HPQ、(NH4) 2 SQ、 NH4 Cl放入三角瓶中，配成200ml溶液。(2)加塞包裝。(3)滅菌 0.14Mpa , 121c ,20min。(4)接種 接種前一級種子需先放在恒溫培養(yǎng)箱活化(37C、12h),冷卻后接 種。(5)培養(yǎng) 放入氣浴恒溫振蕩器中37C ,100r/min培養(yǎng)13h后，鏡檢，觀察菌 的生長情況。菌體進(jìn)入對數(shù)生長期即可作為二級種子液用于分批培養(yǎng)發(fā)酵

13、實(shí)驗(yàn)。1.2.5 產(chǎn)0c 淀粉酶枯草芽胞桿菌分批培養(yǎng)發(fā)酵(1)稱量 根據(jù)需要量計(jì)算并依次稱量豆餅粉、 玉米粉、Na2 HPQ、(NH4) 2 SQ、 NHCl、CaCL、a一淀粉酶，放入發(fā)酵罐中加入蒸儲水配制2.5L發(fā)酵液。(2)滅菌 0.14Mpa , 121c ,20min。(3)接種(4)啟動(dòng)發(fā)酵罐，調(diào)節(jié)發(fā)酵系數(shù)，開始發(fā)酵。發(fā)酵參數(shù)：溫度37C轉(zhuǎn)速200r/min通氣量1.33VVm(012h)2.67VVm (12h一發(fā)酵結(jié)束)pH 值6.5(5)測PH值，繪制生長曲線，并進(jìn)行鏡檢，觀察菌體生長狀況。(6)發(fā)酵結(jié)束，放罐。第二章結(jié)果與分析2.1 菌種篩選及保藏由于實(shí)驗(yàn)要篩選的菌種已經(jīng)很

14、純了，所以此次實(shí)驗(yàn)所提到的“篩選”，是要篩選出有活力的、生長狀態(tài)良好的純種枯草芽抱桿菌。通過加入少量的可溶性 淀粉酶，可以使菌種進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，這樣篩選出來的菌株可以更好地產(chǎn)a 一淀粉酶。篩選出來的菌種要進(jìn)行保藏，此實(shí)驗(yàn)的保藏方法是放在冰箱中保藏。2.2 擴(kuò)大培養(yǎng)此次實(shí)驗(yàn)采用一次擴(kuò)大培養(yǎng)，方法是搖瓶培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)用的培養(yǎng)基與發(fā) 酵培養(yǎng)基相似。在氣浴恒溫振蕩器中，發(fā)現(xiàn)搖瓶中變渾濁，而且表面有很多氣 泡，這說明菌體開始生長了。培養(yǎng)特定時(shí)間后，生長出來的菌種就可以用于發(fā) 酵了。2.3 發(fā)酵發(fā)酵采用的方式是分批培養(yǎng)發(fā)酵，在一切做好準(zhǔn)備后，進(jìn)行無菌操作，把 菌體放入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。整個(gè)過程都是需要時(shí)刻

15、進(jìn)行調(diào)節(jié)的，主要的調(diào)節(jié) 項(xiàng)目為溫度、pH值，因?yàn)榫w在生長的各個(gè)階段，溫度和 pH都有所變化，而想 要生產(chǎn)出產(chǎn)品，就要控制好這兩個(gè)參數(shù)。溫度控制主要通過加冷卻水來進(jìn)行， 但要注意適量，不能太過。pH值的控制主要通過加氨水來調(diào)節(jié)，因?yàn)殡S著菌體 生長和產(chǎn)物產(chǎn)生，環(huán)境pH值會不斷下降呈酸性，所以要不斷加氨水來控制第三章結(jié)論枯草芽抱桿菌在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件掌握不好，常出現(xiàn)活菌數(shù)量低,芽抱形成率低等問題。本研究通過一系列單因素實(shí)驗(yàn)，確定了枯草芽抱桿菌的最 佳發(fā)酵條件。通過對枯草芽抱桿菌進(jìn)行篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵的控制，很好的 了解了生物產(chǎn)品生產(chǎn)的中游部分的各個(gè)步驟，初步學(xué)習(xí)了這幾部分的主要注意 事項(xiàng)

16、，尤其對發(fā)酵有了一個(gè)初步的認(rèn)識，學(xué)會了控制發(fā)酵的相關(guān)參數(shù)。通過測 量PH值，也了解了菌體的生長趨勢。培養(yǎng)基優(yōu)化方法多是在單因素水平試驗(yàn)的 基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或是在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)理論，或者采用 通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，均能對培養(yǎng)基優(yōu)化取得較好的效果。在工業(yè)化生產(chǎn)中，還 需要對接種量、pH溫度、轉(zhuǎn)速、通風(fēng)比、溶氧、以及消泡劑用量等一系列因 素進(jìn)行嚴(yán)格控制，才能保證枯草芽抱桿菌發(fā)酵活菌數(shù)達(dá)到最高、發(fā)酵效果最好、 在動(dòng)物飼料里的添加效果最理想。第四章參考文獻(xiàn)1吳玲，何穎.瑞士乳桿菌增菌培養(yǎng)基的篩選J.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 學(xué)報(bào),Vol. 4 2007 December No.54.2西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，Vol.38 No.7 Ju.1.2010.3馮宇，高年發(fā)，張