湘雅分子生物學(xué)PBL

1、 蛋白質(zhì)印跡法 蛋白質(zhì)雙向電泳蛋白質(zhì)雙向電泳 檢驗(yàn)檢驗(yàn)13011301潘萌萌潘萌萌蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法（western-blot)基本原理器材、試劑實(shí)驗(yàn)步驟基本原理 通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。 將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原。 還還原型原型細(xì)胞色素細(xì)胞色素P450與一氧化碳有特殊的親和力，且形成的復(fù)合物在波長450nm處有一特異吸收峰。 常用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDSPAGE）法）法分離蛋白質(zhì)

2、。SDS是一種陰離子去污劑，它能與絕大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合，結(jié)合后蛋白質(zhì)將帶上等量的負(fù)電荷，同時結(jié)合后蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象發(fā)生改變，此時蛋白質(zhì)的電泳遷移率僅與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)。 分離后的蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，因而用電轉(zhuǎn)移的方法能有效地將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體固相載體上（如硝酸纖維素膜）。用于承載蛋白質(zhì)的各種膜均具有一個特點(diǎn)，它們都能與蛋白質(zhì)發(fā)生非特異的共價結(jié)合，因而結(jié)合較為牢固，不易被后續(xù)的洗膜等操作洗脫?；驹?所用的探針探針為針對靶蛋白某段氨基酸序列的抗體。能直接與靶蛋白發(fā)生抗原抗體結(jié)合的抗體稱為第一抗體第一抗體（簡稱一抗），較難大量獲得該抗體，使得對其進(jìn)行標(biāo)記很困難。能與一抗結(jié)合的抗體，為第第二抗體

3、二抗體（簡稱二抗）。二抗將一抗的FC段作為抗原，而每一物種的抗體FC段氨基酸序列都較為保守，這使得二抗能夠大量生產(chǎn)，因而對二抗進(jìn)行標(biāo)記也就較為容易了。二抗與一抗能通過抗原抗體特異性結(jié)合后，以一定的方法對二抗上的標(biāo)記進(jìn)行，檢測便可檢出靶蛋白。器材、試劑器材：器材：電熱水浴箱、玻璃勻漿器、冷凍離心機(jī)、濾紙、水平搖床、電轉(zhuǎn)移裝置、醋酸纖維素膜（NC膜）、電泳儀、試管、微量移液器、Tip頭、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml）試劑：試劑：1.5M TrisHcl, pH8.8；1.0M TrisHcl, pH6.8；10SDS； 10TBS（Tris buffer solution）, pH7.

4、6；TBS-T，pH7.6；5電泳緩沖液，pH8.3；轉(zhuǎn)移緩沖液（25mM Tris、 192 mM甘氨酸、20甲醇），pH8.3；10mM PMSF液；裂解緩沖液；PBS；10過硫酸胺（APS）；1溴酚藍(lán)；30%丙烯酰胺；Sample Buffer（上樣緩沖液）實(shí)驗(yàn)步驟1. 樣品制備樣品制備小鼠禁食過夜，斷頭處死，迅速剖開腹腔，取出肝、腎分別稱重按1g組織中加入冰預(yù)冷的10 ml裂解液，10mM PMSF 1ml 冰上制成10的組織勻漿取1ml勻漿20000g，4、離心30分鐘小心吸取上清液取少量上清液進(jìn)行蛋白定量，余下的-20保存?zhèn)溆?.蛋白質(zhì)定量（考馬斯亮藍(lán)染色法） 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)

5、G250 是一種蛋白質(zhì)染料，最大吸收峰在465nm,當(dāng)它與蛋白質(zhì)以范德華力結(jié)合形成考馬斯亮藍(lán)G250蛋白質(zhì)復(fù)合物，其最大吸收峰改變?yōu)?95 nm，其吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。按下表操作。 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算測定管的濃度3.制SDS-PAGE膠裝配好制膠玻璃板配制12的分離膠，再加入APS和TEMED將上述溶液緩慢注入制膠玻璃片至梳齒下1cm,操作中注意防止產(chǎn)生氣泡，聚膠30分鐘后用ddH2O完全洗凈封閉液按下列配方配制5的聚集膠，再加入APS和TEMED注入聚集膠前，用濾紙吸干分離膠上的水。緩慢注入聚集膠，過程中注意防止產(chǎn)生氣泡。插入梳齒，聚膠30分鐘后小心拔除

6、梳齒用ddH2O清洗梳孔，放入電泳槽備用4.樣品處理 用Sample Buffer 按1：1稀釋樣品 95加熱變性5分鐘5.上樣及電泳：將電泳槽內(nèi)注滿1電泳緩沖液，徹底除去點(diǎn)樣孔中和膠底的氣泡。兩邊空白的泳道點(diǎn)上等量的 Sample Buffer ，上樣量（20l含40g蛋白）向電泳外槽內(nèi)注入1電泳緩沖液，蓋上蓋子，電泳開始時電壓為80V，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到120V，穩(wěn)壓，當(dāng)染料抵達(dá)分離膠底部約80分鐘，斷開電源。6.轉(zhuǎn)膜剪6塊濾紙和一塊NC膜，其大小與膠相同將濾紙預(yù)先在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘，除去氣泡。凝膠電泳完成后取出。按照海綿海綿3塊濾紙塊濾紙凝膠凝膠NC膜膜另外另外3塊塊濾

7、紙濾紙海綿海綿的順序依次放，應(yīng)避免氣泡。用塑料支架夾緊上述各層，放入轉(zhuǎn)移內(nèi)槽及外槽，注入冰預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。注意NC膜一側(cè)靠正極，膠一側(cè)靠負(fù)極。轉(zhuǎn)移200mA穩(wěn)流，4，1.5小時。NC膜膜7.封閉NC膜轉(zhuǎn)移完成后，取出膜放在濾紙上，用鉛筆標(biāo)好正面，室溫干燥數(shù)分鐘。用western blotting封閉液封閉NC膜，室溫下振蕩1小時后4過夜（NC膜正面向上）8.一抗結(jié)合一抗用封閉液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(-actin)配制）室溫振搖2小時（NC膜正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分鐘9.二抗結(jié)合二抗以TBS-T稀釋（按1：600配制）室溫振搖孵育1.5小時（NC膜

8、正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分鐘10.顯色：辣根過氧化物酶顯色 在試管中先加入1mlHRP反應(yīng)緩沖液，然后依次加入試劑A500l、試劑B500l、C500l混勻即可。 配制好的溶液應(yīng)避光存放，30min內(nèi)使用，染色為褐色。 室溫下染色時間為530min，可根據(jù)顏色變化掌握染色時間。 等目的條帶顯色后，用少量PBS清洗。11.照相保存，凝膠圖象分析 CYP1A1的分子量為56Kda，-actin的分子量為43Kda蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的雙向電泳的第一向?yàn)榈入娋鄣入娋劢菇梗↖soelectrofocusing,IEF）,根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離；第二向?yàn)镾DS-SDS

9、-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-SDS-PAGEPAGE），按亞基分子量大小進(jìn)行分離。經(jīng)過電荷和分子量兩次分離后，可以得到蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)和分子量信息。簡介雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS-PAGE（按照分子大?。?，經(jīng)染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質(zhì)圖。是一種特殊的聚丙烯酰胺凝膠電泳，其特點(diǎn)是在凝膠中加入一種兩性電解質(zhì)載體，從而使凝膠在電場中形成連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)是典型的兩性電解質(zhì)分子，它在大于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陰離子形式向電場

10、的正極移動，在小于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中以陽離子形式向負(fù)極移動。這種泳動只有在等于等電點(diǎn)的pH環(huán)境中才停止。如果在一種pH梯度的環(huán)境中將含有各種不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行電泳，那么在電場作用下，不管這一群混雜的蛋白質(zhì)分子原始分布如何，各蛋白質(zhì)分子將按照它們各自的等電點(diǎn)大小在pH梯度相對應(yīng)的位置進(jìn)行聚集經(jīng)過一定時間后，不同的蛋白質(zhì)組分便分割在不同的區(qū)域之中。這個過程稱作等電聚焦蛋白質(zhì)聚集的部位蛋白質(zhì)所帶電荷為零，測定此部位的pH值，即可知該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。主要用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量，SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶劑，它能段裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級

11、和三級結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑則能使半光氨酸殘基之間的二硫鍵段裂。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，分子被解聚成它們的多肽鏈。解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這就消除了不同分子之間原有電荷的差異。因此這種膠束在SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD到200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)器材和試劑1、凝膠原液（28.38%Acr +1.62%Bis）。2、TEMED原液。3、過硫酸銨。4、pH3.510、pH

12、46、pH68兩性電解質(zhì)載體。5、尿素。6、10%非離子去污劑NP-40。7、50mmol/L NaOH；。8、25mmol/LH3PO4 。9、SDS。10、60mmolTris-Cl pH6.8。11、2-巰基乙醇。12、10倍SDS-PAGE電極緩沖液（0.25mol/L Tris-HCl,1.92mol/L 甘氨酸，1%SDS）。13、0.05%溴酚藍(lán)。14、1%瓊脂。15、蛋白質(zhì)抽提液（30mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/LMgCl2,6mmol/L抗壞血酸，1%PVP，5%甘油，0.02% 2-巰基乙醇）。16、丙酮。17、研缽，石英砂，燒杯，試管，玻棒

13、，量筒。18、雙向電泳槽一套（包括圓盤電泳槽和垂直板狀電泳槽等），電泳儀 Sephdex聚葡萄糖凝膠 THMED液四甲基乙二胺等電聚焦系統(tǒng)電泳槽實(shí)驗(yàn)方法電泳視頻醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究蛋白質(zhì)組學(xué)最關(guān)鍵的技術(shù)之一研究蛋白質(zhì)組學(xué)最關(guān)鍵的技術(shù)之一目前病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)和腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的研究正在興起，而雙向電泳技術(shù)是研究蛋白質(zhì)組學(xué)最關(guān)鍵的技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究工作，如通過尋找差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，尋找用于診斷的疾病相關(guān)標(biāo)記分子，尋找疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)藥靶，以用于藥物設(shè)計，研究疾病的致病機(jī)理等。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，如液相，蛋白質(zhì)芯片結(jié)合技術(shù)的應(yīng)用，蛋白質(zhì)組學(xué)必將得到進(jìn)一步的

14、發(fā)展，并在疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療方面發(fā)揮重要的作用。蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)為人類疾病，特別是惡性腫瘤的早期診斷和治療方面已顯示出了廣闊的前景，必將造福于人類。醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用腫瘤耐藥性的研究腫瘤耐藥性的研究朱蓉在硼替佐米耐藥骨髓瘤細(xì)胞株的建立及其耐藥機(jī)制研究中采用雙向電泳及質(zhì)譜鑒定技術(shù)，分析差異蛋白的表達(dá)情況。并選取其中部分差異蛋白，采用westernblot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。留取臨床患者原代標(biāo)本，進(jìn)行westernblot檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證雙向電泳結(jié)果，并分析差異蛋白與硼替佐米耐藥的相關(guān)性。通過比較分析抗腫瘤前后的雙向電泳蛋白圖譜，可以找到與腫瘤耐藥性有關(guān)的蛋白。醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究微生物相關(guān)蛋白研究微生物相關(guān)蛋白馬翔宇在新型多價大腸桿菌噬菌體285P分離鑒定及功能基因組學(xué)研究中提到，噬苗體285P經(jīng)純化濃縮的樣品進(jìn)行雙向電泳，結(jié)合SDSPAGE電泳、雙向電泳及質(zhì)譜分析技術(shù)，并和基因組學(xué)數(shù)據(jù)相互佐證，確定