轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的基因構(gòu)建與表達

1、轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的基因構(gòu)建與表達摘要 近年來，生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的成就促進了轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的蓬勃發(fā)展。用轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是生物技術(shù)領(lǐng)域里的又一次革命，它以一個全新生產(chǎn)珍貴藥用蛋白的模式區(qū)別于傳統(tǒng)藥物的生產(chǎn)。本文著重介紹轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的基因構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因動物組織特異性表達的最新進展。 以合理的費用獲取大量在人體內(nèi)原本稀少的血漿蛋白在不久前還只是幻想。然而，近年來生物學(xué)和分子生物學(xué)取得的顯著進展終于使這種幻想成為現(xiàn)實。其中，將外源DVA用顯微技術(shù)注入生殖細胞的原核，將重組DVA轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞和將DVA整合入宿主染色體和種系傳遞等重要發(fā)現(xiàn)，使用轉(zhuǎn)基因（Tg）

2、動物生產(chǎn)藥用蛋白成為可能。此外，生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如對卵細胞的獲得、操作以及再植入和重組DNA等技術(shù)進步都為轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的成功提供了保證。 轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白一般有兩種技術(shù)路線。第一種是將目的基因在同源組織中表達蛋白質(zhì)；第二種是將目的基因構(gòu)建成雜合基因，轉(zhuǎn)入動物胚胎，通過轉(zhuǎn)基因動物的分泌器官收集并提純藥用蛋白。轉(zhuǎn)基因動物分泌的蛋白經(jīng)過后加工酷如人體天然蛋白的結(jié)構(gòu)，也有完全相似的生物活性。 同源組織中表達蛋白質(zhì) 目前，在同源組織中表達蛋白質(zhì)最典型的例子是在動物的紅細胞中表達人的血紅蛋白。在人的血紅蛋白基因編碼序列里啟動子有2個CACCC盒，而對應(yīng)的豬的啟動子里只有一個，另一

3、個靠近它的是CGCCC盒。Sharma等1將豬的-啟動子與人的編碼基因融合，并將人的-基因座調(diào)控區(qū)（-LCR）和、基因與融合基因的基因連接在一起構(gòu)成載體，轉(zhuǎn)入豬胚胎細胞，從轉(zhuǎn)基因豬分泌乳汁中得到的重組人血紅蛋白含量高達32g/L。 在轉(zhuǎn)基因動物的分泌器官中生產(chǎn)蛋白 轉(zhuǎn)基因動物表達重組蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱為靶位。在這些表達器官中，通過構(gòu)建合適的載體，選擇適當(dāng)?shù)膯幼雍驼{(diào)控序列可產(chǎn)生比正常水平高得多的重組蛋白。不過，生產(chǎn)系統(tǒng)應(yīng)盡可能與循環(huán)系統(tǒng)隔離，以減少表達產(chǎn)物對宿主動物的影響。 乳腺生物反應(yīng)器 將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動物胚胎細胞，使轉(zhuǎn)基因動物分泌的乳汁中含有所需

4、要藥用蛋白。從融合基因轉(zhuǎn)入胚胎細胞到收集蛋白質(zhì)有一個過程，包括胚胎植入、分娩和轉(zhuǎn)基因動物的生長。轉(zhuǎn)基因動物從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個月；并且只有雌性動物泌乳且不連續(xù)，一般可持續(xù)2、6、10個月。牛、羊等大型家畜能對藥用蛋白進行正確的后加工，使之具有較高的生物活性，同時產(chǎn)奶量大，易于大規(guī)模生產(chǎn)，因而成為乳腺生物反應(yīng)器理想的動物類型。 抗凝血酶 第一個進入臨床試驗的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物是抗凝血酶，將半乳糖-酪蛋白的啟動子和含抗凝血酶基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白產(chǎn)量可達7g/L2。目前該蛋白正用于冠狀動脈旁路手術(shù)患者的二期臨床驗證。 -

5、乳球蛋白 在實驗過程中人們發(fā)現(xiàn)牛的-乳球蛋白（BLG）基因非常穩(wěn)定，并能在乳腺中特異性表達。Hyttinen等3將含有5端2.8kb和3端1.9kb的牛BLG基因片段構(gòu)建成載體，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞，可在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺中特異表達高水平的BLG，此外，還發(fā)現(xiàn)CpG位點的甲基化程度與BLG的表達量有關(guān)，甲基化少的轉(zhuǎn)基因小鼠乳液中BLG分泌量較大，可達12mg/ml，而其他轉(zhuǎn)基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。 紅細胞生成素（EPO） 目前國內(nèi)外均采用CHO細胞表達生產(chǎn)人EPO，成本比較昂貴，而用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的EPO，可能是一條理想的途徑。將EPO dNA分別以Hind和BamHI酶切，1%瓊脂糖凝

6、膠電泳回收5.4kb的Hin/BamHI片段，插入pGEM-7zf(+)載體，再將867bp的BLG啟動子插入EPO基因之前EcoR、ClaI位點，構(gòu)建表達載體pGEM-3zf(+)-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉(zhuǎn)基因小鼠乳汗中的EPO含量可達0.5g/ml4。 1-抗胰蛋白酶 這也是一個利用B LG基因構(gòu)建的重組蛋白。將BLG5末端4.0kb序列與人的1-抗胰蛋白酶（1AT）基因的6.5kb片段（去掉第一個內(nèi)含子）融合，再連接羊的BLG啟動子，以pPOLY-為載體，轉(zhuǎn)入羊的胚胎細胞，可在轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳液中得到含量高達60.0mg/ml的重組蛋白1AT5。轉(zhuǎn)基因在兩年前進入了臨床驗證。

7、 因子 Schnieke等6將羊的BLG基因5末端和人的因子 cDNA 與含有BLG復(fù)制單元和3末端的片段融合，將構(gòu)建的雜合基因轉(zhuǎn)入羊的胚胎細胞，從分泌的乳汁中得到125g/ml的重組蛋白。黃淑幀教授等7構(gòu)建了一個含有小鼠MAR元件、牛-酪蛋白基因調(diào)控序列和hF微基因的hF乳腺組織特異性表達載體pMCm，其中hF 微基因包括全長hF cDNA ，800bp經(jīng)過改造的內(nèi)含子1序列和hF蛋白的信號肽序列。將線形化的表達載體pMC m導(dǎo)入羊的受精卵。轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳汁中hF蛋白的含量約為95ng/ml。在另一實驗中，Yull等8將BLG5末端序列，f編碼序列和缺失隱性3端連接點的f 3末端不翻譯區(qū)域

8、的一個小片段融合，構(gòu)成雜合基因，去掉SphI和SmaI位點，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞，得到的重組蛋白產(chǎn)量達0.06mg/ml。經(jīng)過進一步研究，發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動物乳腺中對DNA的錯誤剪切使分泌量降低，從而增高重組蛋白產(chǎn)率。在乳腺組織中表達有完全活性的因子是比較成功的，尤其是乳腺組織對因子 N端附近的一段含12個葡萄糖殘基的序列進行-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)-羧化作用。 因子 人FcDNA長約7.2kb，是目前為止表達的最長cDNA。將它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中啟動子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌F重組蛋白。在WA

9、P/FcDNA構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠中rF表達最低，而在轉(zhuǎn)基因豬中可達1.02.7g/ml9。 單克降抗體 Castilla等10將編碼了重組單克降抗體（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠基因組的第一個外顯子，使rMab 6A.C3的表達可以由WAP基因調(diào)控序列來控制，將構(gòu)建的雜合基因注入小鼠胚胎細胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的單克降抗體，這種轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物將廣泛應(yīng)用于預(yù)防新生兒腸道感染。 C蛋白 同樣在WAP基因的第一個外顯子位點，Drews等11將人C蛋白cDNA插入，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞，可得到產(chǎn)量達1.6mg/ml的重組蛋白。而將上述雜合基因轉(zhuǎn)入豬的胚胎細胞，可使豬分泌出380

10、g/mlg/ml·hr的外源蛋白，活性與人血漿中C蛋白的活性相同。由于C蛋白的抗凝活性依賴于輕鏈膜結(jié)合區(qū)域正確的-羧化，因此，轉(zhuǎn)基因豬能分泌有活性的C蛋白表明豬的乳腺細胞可對C蛋白前體高速率地進行-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。 膀胱生物反應(yīng)器 膀胱反應(yīng)器有著和乳腺反應(yīng)器一樣的優(yōu)點：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不必對動物造成傷害。此外，該系統(tǒng)可從動物一出生就收集產(chǎn)物，不論動物的性別和是否正處于生殖期。膀胱生物反應(yīng)器最顯著的優(yōu)勢在于從尿中提取蛋白質(zhì)比在乳汁中提取簡便、高效。 膀胱生物反應(yīng)器多用Uroplakin啟動子啟動人生長激素（hGH）的表達，產(chǎn)生 hGH特異性的高豐度RNA，這些R

11、NA與蛋白分泌量高度相關(guān)。Uroplakin基因在多種哺乳動物體內(nèi)有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。 生長激素 Kerr等12將pUPII-LacI用質(zhì)粒的Kpn i進行消化，用T4DNA多聚酶切去3端，然后用BamHI消化，分離出3.6kb的5端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反應(yīng)器特異性表達所需的大部分序列。將此片段與位于無啟動子的pOGH質(zhì)粒純化SaI和BamHI位點間的hGH結(jié)構(gòu)基因的5端連接，得到pUPII-hGH質(zhì)粒，能表達該質(zhì)粒的組織分布有限。將得到的pUPII- hGH質(zhì)粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用于顯 微注射，

12、在膀胱上皮細胞中合成hGH，收集轉(zhuǎn)基因動物尿液，從中提取重組蛋白。但在這一途徑中轉(zhuǎn)基因動物會因hGH的作用逐漸肥胖，并導(dǎo)致雌性動物不育癥。乳腺生物反應(yīng)器也能表達hGH。用同源重組方法將hGH基因?qū)?10kb的人-乳球蛋白位置依賴性YAC載體，將重組的YAC dNA顯微注入大鼠胚胎，轉(zhuǎn)基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可達0.258.9mg/ml13。 翻譯與修飾 轉(zhuǎn)基因動物分泌的蛋白，特別是糖鏈成分的結(jié)構(gòu)與人體蛋白有差異。因此研究分泌蛋白的修飾就顯得很重要。在乳腺生物反應(yīng)器中，蛋白質(zhì)翻譯前修飾的主要方式是在多個位點對乳腺中的蛋白前體進行信號肽剪切和對糖鏈進行修飾。例如，從山羊乳液中得到

13、的長效組織型纖溶酶原激活劑與人體內(nèi)和相比較，含有少量的異種（外源）低聚糖，同時，唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明顯減少，關(guān)且出現(xiàn)缺少蛋白質(zhì)C127的N-乙酰半乳糖胺。此外，從豬乳液中得到的C蛋白中是沒有的；從羊乳液中得到的重組1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差異；在山羊乳腺中觀察到了重組抗凝血酶上低聚甘露糖與特異天冬酰胺的位點特異性聚合等等。研究小鼠乳液中的重組-干擾素可對翻譯前修飾有更好的理解，-干擾素有大量的位點特異性變化，在N端連接位點進行復(fù)雜的唾液酸酸化和連接核心巖藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。與從小鼠細胞中取得的蛋白質(zhì)相比，分泌的重組蛋白沒有GalNAc、NeuGC和

14、Gall 、3Gal-l、 4GlcNAc殘基。這些蛋白特異性的糖基化類型可與細胞上的受體結(jié)合并清除病人體內(nèi)的重組蛋白，因此可能會影響療效，最終的結(jié)果尚有待驗證。 同源組織表達蛋白質(zhì)的優(yōu)點是可對表達產(chǎn)物進行調(diào)控并校正珠蛋白鏈的翻譯過程，避免無效的翻譯前修飾，使產(chǎn)物蛋白盡可能與人體天然蛋白相似，降低人體內(nèi)的排斥反應(yīng)，提高藥物蛋白療效。目前，蛋白分離技術(shù)飛速發(fā)展，大大提高了蛋白質(zhì)分離的可行性和分離效率。第二種技術(shù)路線中目前以乳腺生物反應(yīng)器較為多見，因為乳汁易得到，且乳汁中的特異蛋白含量較大，對蛋白水解酶的降解作用也比較穩(wěn)定。乳汁是一種混合物，含3%6%的總蛋白，3%5%的脂類，對蛋白提純技術(shù)要求比

15、較高。另一方面，藥用蛋白是在動物乳腺中產(chǎn)生。因此只有含轉(zhuǎn)基因型人雌性動物在泌乳期才能生產(chǎn)藥用蛋白，可用的動物數(shù)目有限，且生產(chǎn)期較短。膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點在于含有轉(zhuǎn)基因型的兩性動物都可用，產(chǎn)后收集時間長，提取產(chǎn)物蛋白濃度雙乳液中的含量低得多，盡管收集的尿液多且時間長，生產(chǎn)單位數(shù)量的藥用蛋白在乳腺和膀胱生物反應(yīng)器中的成本是差不多的 問題與展望 在轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的應(yīng)用中，有些問題尚待解決。比如，由于轉(zhuǎn)基因動物的基因是鑲嵌整合型的，因此它的下一代并不都轉(zhuǎn)基因型。但是在綿羊，豬和山羊中觀察到只要轉(zhuǎn)基因型從起始個體傳給了下一代，這種轉(zhuǎn)基因型就可以穩(wěn)定地遺傳好幾代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低

16、，胚胎移植的受孕率低等都使有效的轉(zhuǎn)基因動物大大減少。同時，由于對調(diào)控表達水平的程序，指導(dǎo)進行精確的組織特異性和發(fā)育調(diào)控表達的程序，以及調(diào)控和編碼內(nèi)含子序列間可能的相互作用的認識尚不充分14，容易引起異位點表達；由于現(xiàn)在的技術(shù)還不能控制整合的位點，因此存在對內(nèi)源基因進行插入誘變的可能性，轉(zhuǎn)基因型的表達會受整合的不同位點的影響。這些因素使得在家畜長成前，要用小鼠對新基因構(gòu)型進行常規(guī)試驗。 轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥用蛋白可用于預(yù)防和治療疾病，其轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及口服用藥引起的耐受性等問題都在作進一步研究。以轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白具有重大的經(jīng)濟價值和社會效益，這項生物技術(shù)最終將會得到廣泛應(yīng)用。 參考文獻 1S

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