沙棘葉中多糖的初步研究多杰才旦

1、沙 棘 葉 中 多 糖 的 初 步 研 究分類： 畢業(yè)論文200706摘 要 本實驗首次探討了沙棘葉中多糖的提取分離，測定其多糖的百分含量。首先用蒸餾水清洗干葉，以洗掉塵土、浮渣，去掉粗梗，剪細(xì)。適量石油醚反復(fù)脫脂，濾渣自然揮干，再用常溫水浸泡一次，80熱水浸泡兩次，以提取水溶性物質(zhì)，然后合并所有水提液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在適宜條件（t50，抽真空0.09Mpa）下濃縮溶液至適宜體積，sevage法反復(fù)操作去蛋白，最后用95的乙醇使溶液達到不同的濃度而沉淀出多糖，優(yōu)選出沉淀沙棘多糖的最優(yōu)醇濃度。05冰箱中放置48小時后，過濾時用無水乙醇，丙酮洗數(shù)次，真空抽干。粗產(chǎn)品重新溶解于適量水中，然后通過大孔

2、樹脂進行純化，蒸餾水洗脫，洗脫液在PH值為8時，用20的H2O2，50以下保溫2h脫色，以保證產(chǎn)品的顏色，最后用95的乙醇使溶液醇濃度達到80以析出多糖，重復(fù)上面的析糖操作，最后保存產(chǎn)品于干燥處。用D（）葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)，苯酚硫酸法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程，從而得到粗多糖的含量，由此也可以算出沙棘葉中多糖的百分含量。然后進行TLC法初步定性確定多糖成分，再進行核磁共振定性分析，即可檢驗其準(zhǔn)確成分。關(guān)鍵詞 沙棘；多糖；提取；脫蛋白；AB8大孔樹脂 Abstract The experiment is the first to research the Hippohae rhamnoides L

3、 leaves polysaccharides .The popose of the experiment is taking the polysaccharides from the Hippohae rhamnoides L leaves. First wash the leaves through the water to clean the dirt away, then use petroleum ether to degrease the leaves many times, extract the water-soluble material through hot water

4、of 80, utilizing the revolval-evaporation under the condition( t=50 , vacuum 0.09 Mpa) to concentrate the aqua to the proper physical volume . Isolation and composition of polysaccharides from the aqua ,alcohol precipitate by hot water extraction and remove protein from polysaccharides by sevag,in o

5、rder to get optimum alcohol concentration from precipitating Hippohae rhamnoides L polysaccharides.And also try polysaccharides purified by AB-8 Macfofeticulaf Resin to achieve good results.Finally sum up the optimum technology of extraction and purification polysaccharides from the leaves. then lyi

6、ng in the refrigerator(0-5)two days,fitrated by alcohol , acetone,more than three times .Dissolve into the proper water again;through AB8 Macfofeticulaf Resin,water cleanse; add the sodium hydroxide to make the waters PH 8 ,use the hydrogen peroxide (20% ) ,below 50 preservation 2 hours to ensure th

7、e color of the products.;then alcohol precipitating again.With the D(+)- the glucose as the standard to figure out the standard curve in the way of “phenol-sulfuric acid”,thus obtaining the containment of the cude polysaccharides.This method will increase the production of polysaccharides,and the us

8、e of AB8 Macfofeticulaf Resin will enhance the purity of the products and reduce the cost.Key wordsHippohae rhamnoides L ;Polysaccharides; Extraction; Removal from polysaccharides；AB8 Macfofeticulaf Resin.1前言沙棘（Hippohae rhamnoides L.），胡頹子科植物，分布于歐亞大陸的溫帶、寒溫帶及亞熱帶髙三區(qū)。我國的東北、華北、西北和西南等地區(qū)是沙棘屬植物的主要分布區(qū)。由于沙棘屬植

9、物具有極強的生態(tài)適應(yīng)性并富含多種營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，已引起各國工作者的廣泛重視。沙棘是一種富含生物活性物質(zhì)的天然植物，目前已發(fā)現(xiàn)的生化成分達190多種。我國是最早利用沙棘的國家，在成書公元八世紀(jì)的藏醫(yī)學(xué)典籍四部醫(yī)典中就詳細(xì)地記載了它的藥性。但是最早對沙棘進行系統(tǒng)科學(xué)研究的是前蘇聯(lián)學(xué)者，我國對沙棘的研究始于1985年，并將沙棘列為國家科技攻關(guān)項目加以重點研究，如今已有?？臣ㄓ蓢宜恐鬓k）。在前蘇聯(lián)，科學(xué)家開發(fā)利用沙棘由食用轉(zhuǎn)向以生化研究為基礎(chǔ)的醫(yī)用研究，并將沙棘果油和沙棘汁及其制品運用于宇航食品，作為特殊的“日餐必需添加劑”1。而在沙棘的開發(fā)中，黃酮類化合物一直是國內(nèi)外學(xué)者較為關(guān)注的

10、一類物質(zhì)。等人就黃酮類物質(zhì)的分析及其重要作用寫了一篇綜述2。前蘇聯(lián)學(xué)者發(fā)現(xiàn)沙棘黃酮具有扼制動脈粥樣硬化，降低血液中膽固醇等作用。國內(nèi)王家良王秉文等對沙棘的研究較多，其研究表明：沙棘黃酮能顯著增加心臟的收縮和舒張功能有明顯的抗心肌缺血作用及抗心律失常作用34。沙棘有很好的生態(tài)作用。是我國“三北”防護林的主要樹種之一，對于保持和改善那些地區(qū)的水土保持和生態(tài)環(huán)境起了重要作用5。沙棘葉又是優(yōu)良的飼料或飼料添加劑，沙棘具有更高的蛋白質(zhì)和脂肪含量以及更好的適口性6，毒理學(xué)實驗表明，沙棘葉和沙棘殘渣均具無毒物質(zhì)。沙棘的嫩葉還可以炒制茶葉、提取SOD用于化妝品等廣泛用途。綜上所述，沙棘葉中的有效成分豐富，開發(fā)

11、沙棘葉大有可為。目前對于沙棘果汁、果油的開發(fā)研究利用已經(jīng)比較成熟，但是其綜合利用技術(shù)不夠成熟，沙棘葉的研究也不是很多，尤其是沙棘葉中多糖的研究，國內(nèi)外對此有關(guān)的研究還沒有見于發(fā)表，其生理活性目前也尚未證實，但是從相關(guān)報道來看，植物多糖主要有以下生物活性7-14：免疫調(diào)節(jié)、抗癌防癌及抗遺傳損傷、抗輻射及促進骨髓造血機能、降血糖、降血脂（枸杞多糖）及抗動脈粥樣硬化（如云芝多糖）、抗氧化及抗衰老、保肝以及其他抗凝血、抗胃潰瘍、抗炎、抗微生物、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、止喘降血壓作用。而從沙棘葉的多種功用可以估計它的多糖也應(yīng)具有多種活性，而且在提取黃酮的工藝中可以同時充分提取多糖，大大增加沙棘葉的綜合利用價值，創(chuàng)

12、造高價值產(chǎn)品，可對當(dāng)?shù)厝嗣裾业揭粭l可行的脫貧致富途徑。這樣又可調(diào)動當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的積極性，大力種植沙棘對加快黃土高原綜合治理，促進生態(tài)環(huán)境的改變，防止沙漠化等具有重大的社會生態(tài)價值。對綠化荒漠更是形成良性循環(huán)。因此，本文對沙棘葉中多糖的探索研究很有必要，具有開創(chuàng)性意義。因此本實驗首次研究沙棘葉中多糖的提取分離，借鑒其他植物多糖成分的提取方法，再考慮沙棘葉的自身特點，改進傳統(tǒng)分離多糖的方法，采用AB8大孔樹脂分離純化各種多糖，無污染，效率高，節(jié)省成本，優(yōu)選出沙棘葉多糖提取分離的最優(yōu)工藝。測定其中粗多糖的百分含量，然后進行TLC法初步定性確定多糖成分，再進行核磁共振定性分析15-18，即可檢驗其準(zhǔn)確成分

13、。根據(jù)其具體成分，便可以知道沙棘葉中多糖的理論藥理作用。2實驗部分2.1 原料及儀器2.1.1 原料沙棘葉（內(nèi)蒙）；大孔樹脂（AB-8）；石油醚（6090）；工業(yè)酒精（95）；濃硫酸(95.5%)；苯酚(AR)；無水乙醇（AR）；丙酮（AR）；乙醚(AR)；D(+)-葡萄糖(AR)；PH試紙；2.1.2儀器752紫外可見光分光光度計；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；醫(yī)用離心機(4000r/min)；新飛電冰箱；SH2-D（）循環(huán)水式真空泵；2.2 實驗方法2.2.1 原料準(zhǔn)備： （1）試劑的準(zhǔn)備20的H2O2：166.7ml30的H2O2 稀釋定容到250ml；0.05M的NaOH溶液：2gNaOH于

14、1000ml容量瓶中定容；苯酚（5）19：30g苯酚加水70ml使之溶解得到30的苯酚，置于冰箱中避光保存。臨用時振蕩混勻取4ml稀釋至20ml，即為5濃度；樹脂的預(yù)處理及再生20：AB8樹脂用丙酮浸泡數(shù)天，濕法裝柱，再用丙酮洗至流出液與水混合不產(chǎn)生渾濁，再用大量水洗，水浸泡備用。0.05M的NaOH溶液洗至無色，水洗至中性，95的乙醇洗至無色，水洗。（2）沙棘葉的預(yù)處理將干沙棘葉用蒸餾水洗去塵土，時間要迅速， 50烘箱中烘干。篩掉較大的梗和粗枝，將葉子輕輕于研缽中壓碎，不要太碎，放于干燥處備用。2.2.2沙棘葉粗多糖的提?。?）脫脂將100g預(yù)處理過的沙棘葉浸泡于1200ml石油醚中8小時，

15、再換一次石油醚，以石油醚浸過葉子為準(zhǔn)。6小時后倒出石油醚，自然揮干石油醚。（2）提取取脫脂過的葉子40g，分兩份，依次用蒸餾水250ml（常溫）、200ml（80）、150ml（80）均浸泡1小時。合并所有浸提液，共1200ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至400ml（t50，抽真空0.09Mpa）。（3）脫蛋白 脫蛋白有多種方法：三氯乙酸法，sevage法，等等，基于試驗條件，采用sevage法21較為適宜。1/5濃縮液體積的氯仿，1/25濃縮液體積的正丁醇，劇烈振蕩20分鐘，然后攪拌5小時，分液漏斗靜止分層1小時，分離掉有機溶劑和沉淀，再反復(fù)一次，基本可除盡蛋白質(zhì)。（4）醇析除蛋白后的溶液濃縮至50ml

16、，加入95的乙醇使其濃度分別達到50、60、70、80、85。放在05冰箱中48小時。取出后抽濾，分別用無水乙醇，丙酮洗數(shù)次，真空抽干,得到粗產(chǎn)品。2.2.3多糖的純化（1）過柱將得到的粗產(chǎn)品重新完全溶解于適量水中，將預(yù)處理過的AB8樹脂濕法裝柱，控制流速3ml/min，用水洗脫，控制流速6ml/min，洗至洗脫液遞加95的乙醇無沉淀。（2）脫色 濃縮液體至50ml，加入40ml0.05M的NaOH溶液，調(diào)劑PH值至8，再滴加20的H2O2，50以下保溫2h除盡未反應(yīng)完的H2O2。（3）重析 將脫完色的溶液濃縮至50ml，加入95的乙醇使其濃度達到80，使其沉淀完全，放在05冰箱中48小時，取

17、出后抽濾，分別用無水乙醇，丙酮，乙醚洗三次，真空抽干。得到較純產(chǎn)品。干燥處保存。2.2.4總多糖含量的測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備22及樣品含量的測定采用用D（）葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)，苯酚硫酸法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取D（）葡萄糖0.02g，定容100ml，分別取0，0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8。稀釋至5ml，加入1.0ml苯酚（5），搖勻靜止，立即加入5.0ml濃H2SO4,5min后，沸水浴15min，冷水冷卻，紫外可見光分光光度計于490nm波長處比色，測定吸光度，做吸光度A與濃度C（ug/ml）線性回歸方程。精密稱取樣品0.04g，稀釋定容1000ml，同上法測定其吸光度。3 結(jié)

18、果與討論3.1實驗結(jié)果3.1.1實驗數(shù)據(jù)(1)提取數(shù)據(jù)a. 脫脂：曾選用索氏提取法，現(xiàn)與浸泡法比較如下：表一索氏提取法與浸泡法脫脂的比較索氏提取法取30g研磨過的葉片，于虹吸管中加入350ml石油醚，燒瓶中加入400ml，75 oC水浴回流提取5.5h，提取液顏色為黃色；倒出提取液，加入新的石油醚回流提取1h, 石油醚顏色不再加深，停止回流。石油醚為淡黃色浸泡法 30g研磨過的葉片，用石油醚以15：1（體積：重量）的比例浸泡沙棘葉約24小時，倒出石油醚再以10：1的比例浸泡2024小時，石油醚浸提液黃色變淡即可。優(yōu)缺點通過對脫脂后的沙棘葉以及回收石油醚時的剩余物進行稱量，發(fā)覺質(zhì)量相差甚微，幾乎

19、相等；而且對比石油醚提取液顏色，也相差不大，因而浸泡法操作較索氏提取法更簡單，所以本試驗選取浸泡法對沙棘葉進行脫脂處理。b.醇析:濃縮液中加入95的乙醇，使溶液達到不同的醇濃度，其所析出的多糖粗產(chǎn)品如下表：表二 濃縮液在不同醇濃度下析出的粗糖產(chǎn)品編號 沙棘葉（g） 20 20 20 20 20溶液體積（ml） 50 50 50 50 5095醇用量（ml） 55.56 85.7 114.0 266.67 425.0醇濃度（） 50.0 60 .0 70 .0 80.0 85.0產(chǎn)品質(zhì)量（g） 0.543 0.795 0.805 0.991 1.021產(chǎn)品外觀 灰色 黑色 灰和黑 灰白 灰白細(xì)小

20、顆粒 小顆粒 小顆粒 細(xì)小粉末 小顆粒產(chǎn)率 () 2.7 3.975 4.025 4.952 5.105(2)含量測定數(shù)據(jù)： 本步驟利用苯酚硫酸法共測定了兩組數(shù)據(jù)，所用樣品均為醇沉濃度為80%的第組產(chǎn)品。所得到的數(shù)據(jù)見下面兩表：3.1.2結(jié)果處理（1） 相關(guān)與直線方程本實驗采用相關(guān)系數(shù)與直線回歸方程來檢驗所測定的數(shù)據(jù)，相關(guān)系數(shù)“”是測定變量之間相關(guān)密切程度和相關(guān)方向的代表性指標(biāo)。但是相關(guān)分析不能指出兩變量相互關(guān)系的具體形式，也無法從一個變量的變化來推測另一個變量的變化關(guān)系。而回歸方程則是通過一定的數(shù)學(xué)方程來反映變量之間相互關(guān)系的具體形式，以便從一個已知量來推測另一個未知量，為估算預(yù)測提供一個重

21、要的方法。（2） 數(shù)據(jù)處理考慮到有幾組平行數(shù)據(jù)，因此用c語言編程，減少運算量，求得線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)分別為：第一組：A=0.00734 +0.61528 C,=0.88488第二組：A=0.009654 +0.603429 C,=0.99909從結(jié)果中看出第一組數(shù)據(jù)中明顯不合要求，故采用第二組數(shù)據(jù)，作出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：圖五不同濃度的D（）葡萄糖在490nm波長下與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖由圖五可見第二組數(shù)據(jù)基本呈線性關(guān)系，則由標(biāo)準(zhǔn)圖可得樣品中多糖的濃度為：11.6ug/ml 那么可以計算出：a樣品中總多糖的含量為：樣品多糖濃度樣品濃度100即：11.62010058b沙棘葉中總多糖的含量：（產(chǎn)

22、品質(zhì)量樣品多糖含量）沙棘葉質(zhì)量100 即：（0.99158）201002.843.2討論3.2.1預(yù)處理：沙棘葉的預(yù)處理很重要，洗掉塵土，便于產(chǎn)品的純化；葉片不宜過碎，以防熱提取時引起糊化。3.2.2提取部分（1） 脫脂：脫脂時間不宜過短或過長，過短脂溶性物質(zhì)溶解不完全，過長則浪費時間；浸泡時宜少量多次，有利于脫脂（2） 提?。禾崛r也是宜于先泡后加熱，少量多次水提取。加熱的溫度不宜過高，80即可 ，高溫破壞多糖的活性，低溫不利于提取效率。而濃縮時濃縮為原體積的1/3即可，便于脫蛋白時節(jié)省試劑。（3） 脫蛋白：a.除蛋白時宜采用sevage法，但需反復(fù)操作。經(jīng)實驗，劇烈振蕩20分鐘，然后攪拌5

23、小時，分液漏斗靜止分層1小時，兩遍即可。采用三氯乙酸法，雖然效果很好，但是反應(yīng)太劇烈，部分多糖也隨之損耗；b. 將提取液取少量與碘反應(yīng)，呈陰性，說明多糖中并無淀粉或量很少，并不需要加 淀粉酶去除淀粉。（4） 醇析：用醇沉淀之前應(yīng)該濃縮至50ml，便于節(jié)省醇用量，節(jié)省成本。經(jīng)實驗對比可知隨著醇濃度的加大，粗糖產(chǎn)量也隨之增大，但是80和90的醇沉濃度多糖產(chǎn)率相差不多，且高濃度時極有可能沉淀中包含其他大量雜質(zhì)，但是其醇的用量相差很大，從表二中看出用量相差幾乎一倍。因此從經(jīng)濟角度考慮，采用80的醇沉濃度即可。（5） 干燥：過濾采用無水乙醇，丙酮洗洗數(shù)次，盡量不用乙醚，乙醚的沸點很低易揮發(fā)往往帶入空氣中

24、的水分。因此，操作要迅速，且用表面皿蓋住，防止吸取空氣中的水分，否則多糖很容易成為膠質(zhì)而變黑變粘，再溶解時需很長時間。真空抽干時一般不宜采用加熱，因為多糖很容易炭化。3.2.2純化分離部分根據(jù)不同分子量的多糖在大孔樹脂中洗脫出來的先后順序，便可分時間段收集不同的單一多糖。再依次進行濃縮，80濃度的醇沉淀。先進行TLC法初步定性確定多糖成分，再進行核磁共振定性分析，即可檢驗其準(zhǔn)確成分。3.2.3含量測定：a. 5濃度的苯酚應(yīng)該用時用30的苯酚稀釋現(xiàn)配，而30的苯酚應(yīng)置于冰箱中避光保存，因為苯酚易氧化。b.測量吸光度時一定要等到穩(wěn)定后再讀數(shù)，否則偏差很大。c.最后算的多糖含量為2.84，這個含量是

25、不低的，很具有開發(fā)前景，但是具體是哪幾種多糖，還有待進一步檢驗。4實驗總結(jié)本實驗首次探討了沙棘葉中粗多糖的提取分離，通過上面實驗的結(jié)果可以得出沙棘葉多糖提取分離的最優(yōu)工藝是：其多糖含量的測定采用用D（）葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)，苯酚硫酸法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出線性回歸方程及多糖含量。在實驗過程中，由于時間不夠多，使得平行實驗做的較少，從而使得數(shù)據(jù)可能有一定的誤差而沒有進行校正。由于“非典”的嚴(yán)重影響，致使后期進行TLC法初步定性確定多糖成分，以及進行核磁共振定性分析，檢驗其準(zhǔn)確成分等工作無法如期進行，只有待后人再做進一步的研究。參考文獻：1. 張哲民等:前蘇聯(lián)開發(fā)利用沙棘資源得成效的啟示,沙棘,1993，6（1）：45-502. ,et al:Analysis and health effects flavonods. Food Chemistry,1996,57(1):43-463. 趙玉珍等:沙棘中黃酮類化合物及其藥用價值,沙棘，1997，10（1）：39414. 王秉文等:沙棘總黃酮對正常人心功能和血流動力學(xué)的影響,西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1993.14（2）：1301405. 王占孟:沙棘