細菌耐藥表型的檢測方法

1、細菌耐藥表型的檢測方法 細菌耐藥表型的檢測細菌耐藥表型的檢測 一、一、-內酰胺酶的檢測內酰胺酶的檢測（1）頭孢硝基噻吩顯色法（）頭孢硝基噻吩顯色法（Nitrocefin）：制配紙）：制配紙片片滅菌水濕潤滅菌水濕潤涂測試菌于紙片上，涂測試菌于紙片上，10min觀察觀察紙片顏色，顯紅色為陽性（葡萄球菌應放置紙片顏色，顯紅色為陽性（葡萄球菌應放置1h內觀內觀察）。察）。（2）酸度法：青霉素）酸度法：青霉素-內酰胺酶水解內酰胺酶水解青霉酸、青霉酸、以下以下酚紅指示劑由紅色（構櫞酸鈉緩沖液）變?yōu)榉蛹t指示劑由紅色（構櫞酸鈉緩沖液）變?yōu)辄S色。黃色。（3）碘測定法：）碘測定法：-內酰胺酶破壞內酰胺酶破壞-內酰

2、胺環(huán)，碘與內酰胺環(huán)，碘與破壞后的破壞后的-內酰胺結合，使蘭色的淀粉內酰胺結合，使蘭色的淀粉碘復合物碘復合物轉變成無色。轉變成無色。（4）儀器測定法：）儀器測定法：Vitek、Microscan的藥物測試卡的藥物測試卡中均帶有檢酶功能。中均帶有檢酶功能。 二、二、ESBLS檢測檢測（1）紙片擴散初篩：頭孢他啶（）紙片擴散初篩：頭孢他啶（30g/片）片）抑菌圈抑菌圈22mm 頭孢噻肟（頭孢噻肟（30g/片）抑菌圈片）抑菌圈27mm 頭孢曲松（頭孢曲松（30g/片）抑菌圈片）抑菌圈25mm 氨曲南（氨曲南（30g/片）抑菌圈片）抑菌圈27mm（2）肉湯稀釋法：上述藥物）肉湯稀釋法：上述藥物MIC2g

3、/ml可可疑為疑為ESBLS。（表型確證試驗：對。（表型確證試驗：對2個任何個任何一個藥物一個藥物MIC，在加克位維酸比不加克拉，在加克位維酸比不加克拉維酸的維酸的MIC值降低值降低3個以上對倍稀釋度判為個以上對倍稀釋度判為ESBLS）。）。 （3）雙紙片協(xié)同確認試驗：）雙紙片協(xié)同確認試驗：頭孢他啶（頭孢他啶（30g/片）與頭孢他啶（片）與頭孢他啶（30g）/克位維克位維酸（酸（10g）頭孢噻肟（頭孢噻肟（30g/片）與頭孢噻肟（片）與頭孢噻肟（30g）/克拉維克拉維酸（酸（10g）兩紙片抑菌圈相比）兩紙片抑菌圈相比5mm即為即為ESBLS。（4）E-test法（濃度梯度法）：由瑞典法（濃度梯

4、度法）：由瑞典AB Biodisk公司研究生產，廣洲貝肯公司經銷。試條中的三代公司研究生產，廣洲貝肯公司經銷。試條中的三代頭孢菌素或氨曲南的頭孢菌素或氨曲南的MIC2g/ml即可疑為即可疑為ESBLS。（5）儀器測定法：）儀器測定法：Vitek,microscan和和BD-PHOEMXTM微生物分析儀均可測試微生物分析儀均可測試ESBLS。（6）利用分子生物學技術（）利用分子生物學技術（PCR、DNA探針等）探針等）及分析酶底物譜及抑制物譜、生物化學技術等檢及分析酶底物譜及抑制物譜、生物化學技術等檢測技術可對測技術可對ESBLS做出確診。做出確診。 三、三、Ampc酶檢測酶檢測1.初篩：初篩：

5、（1）頭孢西?。ǎ╊^孢西汀（30g/片）與頭孢西?。ㄆ┡c頭孢西汀（30g）/鄰氯西林鄰氯西林（200g）。后者比前者的抑菌圈）。后者比前者的抑菌圈5mm即疑為即疑為Ampc。（2）5種紙片篩選：馬斯平、泰能、頭孢西汀、頭孢他啶與種紙片篩選：馬斯平、泰能、頭孢西汀、頭孢他啶與頭孢他啶頭孢他啶/克拉維酸。如頭孢西汀克拉維酸。如頭孢西汀18mm，對馬斯平、泰能，對馬斯平、泰能敏感即疑為產敏感即疑為產Ampc，如頭孢他啶與其酶抑制劑的抑菌圈，如頭孢他啶與其酶抑制劑的抑菌圈5mm可能產可能產ESBLS。2.確認試驗（頭孢西汀三維水相試驗法）確認試驗（頭孢西汀三維水相試驗法）AmpC酶新的檢測方法酶新的

6、檢測方法3.三維水相試驗方法的改進三維水相試驗方法的改進（1）將標準菌株ATCC 25922按常規(guī)藥敏紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板中心貼一片頭孢西汀(30ug/片) 紙片，在距紙片邊緣1cm處，用無菌手術刀片切3cm長度的小槽，將待測菌株的6個菌落接種于槽內(勿溢出槽外)，35孵育18-24h。（3）結果觀察：若抑菌圈向內凹陷，即AmpC酶陽性。三維水相試驗方法的改進三維水相試驗方法的改進(M-H平板打孔2mm擴散法).AmpC酶新的檢測方法酶新的檢測方法4.質粒型質粒型AmpC酶三聯(lián)紙片方法的檢測酶三聯(lián)紙片方法的檢測（1）將標準菌株ATCC 25922按常規(guī)藥敏

7、紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板中心貼一片頭孢西汀(30ug/片) 紙片，在紙片邊緣貼有待測菌的紙片（紙片上含20ul， ，）。（3）另一側邊緣貼有產AmpC酶菌的紙片（同上）。（4）35孵育18-24h，如待檢菌出現(xiàn)扁平或凹陷的抑菌環(huán)為陽性。 四、金屬四、金屬-內酰胺酶的表型檢測方法內酰胺酶的表型檢測方法1.頭孢他啶+2-巰基丙酸法(CAZ+NCA)（1）將待測菌株按常規(guī)藥敏紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板上分別貼兩片頭孢他啶(30ug/片)紙片，紙片中心相距2.5cm,將其中一片頭孢他啶紙片上加3ul 2-巰基丙酸，35孵育18-24h。

8、（3）結果觀察：若加有2-巰基乙酸的頭孢他啶紙片抑菌圈大于單個頭孢他啶的抑菌圈（4mm），則為陽性，即產金屬-內酰胺酶。金屬金屬-內酰胺酶的表型檢測方法內酰胺酶的表型檢測方法2.亞胺培南+EDTA法(IMP+EDTA)（1）將待測菌株按常規(guī)藥敏紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板上貼一片亞胺培南(10ug/片) 紙片，在距亞胺培南紙片中心處貼無菌空白紙片一片，將0.5M EDTA 10ul 均勻浸注于空白紙片上，35孵育18-24h。（3）結果觀察：若兩片紙片抑菌圈有協(xié)同作用，則為陽性，即產金屬-內酰胺酶。五、腸桿菌科碳青霉烯霉篩選和確證五、腸桿菌科碳青霉烯霉篩選和確證（

9、2009年）年）1.如果菌株對碳青霉烯類藥物表現(xiàn)為“I”或“R”沒必要再去檢驗該酶，（醫(yī)生通常不會選用“I”或“R”的藥物），但主要以感染控制為目的檢驗該酶。2.什么是碳青霉烯酶？一類能水解或滅活碳青霉烯類抗生素的酶，如：KPC（肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶）.v碳青霉烯類抗生素Doripenem（目前無CLSI折點）厄他培南亞胺培南美洛培南3.腸桿菌科碳青霉烯敏感及碳青霉烯酶篩選的折點亞胺培南不用于變形/普羅威登/摩根菌屬中碳青霉烯酶的篩選。因為這些菌屬會產 生非碳青霉烯酶導致的亞胺培南MIC升高。NA：不可用（本試驗不適用于篩查）4.什么時候做改良Hodge試驗？v如果頭孢噻肟、頭孢他啶和 /或

10、頭孢曲松全部“R”。 v注：頭孢比肟對于碳青霉烯酶產生株的結果是不穩(wěn)定的。 v MIC（g/ml) 抑菌圈(mm)v 厄他培南 2 19-21v 亞胺培南 2-4 NA v 美洛培南 2-4 16-215.做改良的Hodge試驗（確證試驗）（1）ATCC25922配成0.5麥氏濁度，1：10稀釋。（2）用棉簽滿涂布于MH平板上，就像紙片擴散法藥敏試驗一樣，在中心加一張厄他培南或美洛培南（最好）紙片。（3）取待測菌（13號）從紙片邊緣向外劃（用1l接種環(huán)）。（4）35培養(yǎng)過夜后，觀察結果。（5）大腸沿著菌株劃線的生長表明碳青霉烯水解酶的產生。6.改良的Hodge試驗：檢測碳青霉烯酶活性的表型試驗

11、，在檢測KPC方面有90的敏感性/特異性，檢測其他碳青霉烯酶時敏感性/特異性不定（如：低水平的金屬酶）。7. 改良Hodge試驗的質量控制(2009年CLSI:M100-S19.APPB.124)： 隨患者菌株每天檢測。（1）改良Hodge試驗陽性菌株: 肺克ATCC BAA-1705 （2） 改良Hodge試驗陰性菌株：肺克ATCC BAA-1706六、六、D-Test試驗試驗（1）將待檢菌按常規(guī)藥敏紙片K-B法操作均勻涂布于M-H平板上。（2）在M-H平上板貼一片紅霉素 (15ug/片) 紙片，在距紙片邊緣處貼克林霉素 (2ug/片) 紙片。（3）35孵育18-24h，如克林霉素出現(xiàn)扁平或凹陷