實(shí)驗(yàn)二.蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)與等電點(diǎn)測(cè)定

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 二二蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)與蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)與等電點(diǎn)測(cè)定等電點(diǎn)測(cè)定生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)n 了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)n 掌握測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法掌握測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康纳锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)PCOOHNH2PCOO-NH3+PCOO-NH2PCOOHNH3+pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI兼性離子兼性離子 陽(yáng)離子陽(yáng)離子陰離子陰離子實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)u 在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)顆粒上的凈電在

2、等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)顆粒上的凈電荷為零，荷為零，缺乏同電相斥的因素缺乏同電相斥的因素，蛋，蛋白質(zhì)溶解度最小，最容易析出沉淀白質(zhì)溶解度最小，最容易析出沉淀u 維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：表面電荷、水化膜表面電荷、水化膜生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)u 本實(shí)驗(yàn)配制了各種不同本實(shí)驗(yàn)配制了各種不同pHpH值的值的緩沖液，沉淀出現(xiàn)緩沖液，沉淀出現(xiàn)最多最多的緩沖液的緩沖液pHpH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)值即為酪蛋白的等電點(diǎn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)器材與試劑實(shí)驗(yàn)器材與試劑 大試管、滴管、刻度吸量管大試管、滴管、刻度吸量管 0.5酪蛋白醋酸鈉溶液酪蛋

3、白醋酸鈉溶液 0.01溴甲酚綠指示劑溴甲酚綠指示劑(指示范圍指示范圍: pH3.8-5.4) 0.02M HCL溶液溶液、 0.02M NaOH溶液溶液 0.01M醋酸溶液、醋酸溶液、0.10M醋酸溶液、醋酸溶液、 1.00M醋酸溶液醋酸溶液生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（1 1）實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟取一干凈試管取一干凈試管酪蛋白液酪蛋白液10滴滴溴甲酚綠指示劑溴甲酚綠指示劑3滴滴觀察溶液顏色觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象并解釋現(xiàn)象生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（2 2）滴加滴加0.02M HCL溶

4、液溶液邊滴加邊混勻邊滴加邊混勻有最大沉淀產(chǎn)生，觀察溶液顏色變化有最大沉淀產(chǎn)生，觀察溶液顏色變化至沉淀消失，觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象至沉淀消失，觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象繼續(xù)滴加繼續(xù)滴加0.02M HCL溶液溶液邊滴加邊混勻邊滴加邊混勻生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（3 3）繼續(xù)滴加繼續(xù)滴加0.02M NaOH溶液溶液邊滴加邊混勻邊滴加邊混勻有最大沉淀產(chǎn)生，觀察溶液顏色變化有最大沉淀產(chǎn)生，觀察溶液顏色變化至沉淀消失，觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象至沉淀消失，觀察溶液顏色并解釋現(xiàn)象繼續(xù)滴加繼續(xù)滴加0.02M NaOH溶液溶液邊滴加邊混勻邊滴加邊混勻生物化學(xué)與

5、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 溶液呈溶液呈藍(lán)色藍(lán)色n 蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)(1)(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 酪蛋白溶液呈堿性酪蛋白溶液呈堿性 (pH(pH5.4)5.4)，使溴甲酚綠，使溴甲酚綠指示劑顯藍(lán)色指示劑顯藍(lán)色生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) H H+ + ，沉淀，沉淀 n 蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)(2)(2) 出現(xiàn)最大量沉淀時(shí)出現(xiàn)最大量沉淀時(shí), ,說(shuō)說(shuō)明到達(dá)了酪蛋白的等電點(diǎn)明到達(dá)了酪蛋白的等電點(diǎn) 溶液由溶液由藍(lán)色藍(lán)色變成變成淺綠色淺綠色（3.83.8pHpH5.45.4）生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 繼續(xù)加酸，繼續(xù)加酸，H

6、H+ + 繼續(xù)增繼續(xù)增大，大，pHpHpIpI。酪蛋白所帶。酪蛋白所帶正電荷不斷增加，同電相正電荷不斷增加，同電相斥，沉淀溶解斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解時(shí)，溶沉淀完全溶解時(shí)，溶液顯液顯黃色黃色(pH(pH3.8)3.8)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) OH OH- - ，沉淀，沉淀 n 蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)(3)(3) 出現(xiàn)最大量沉淀時(shí)出現(xiàn)最大量沉淀時(shí), ,說(shuō)說(shuō)明到達(dá)了酪蛋白的等電點(diǎn)明到達(dá)了酪蛋白的等電點(diǎn) 溶液由溶液由黃色黃色變成變成淺綠色淺綠色（3.83.8pHpH5.45.4）生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 繼續(xù)加堿，繼續(xù)加堿，OHOH- -

7、 繼續(xù)繼續(xù)增大，增大，pHpHpIpI。酪蛋白所。酪蛋白所帶負(fù)電荷不斷增加，同電帶負(fù)電荷不斷增加，同電相斥，沉淀溶解相斥，沉淀溶解 沉淀完全溶解時(shí)，溶沉淀完全溶解時(shí)，溶液顯液顯藍(lán)色藍(lán)色(pH(pH5.4)5.4)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論結(jié)論 1 1：n 酪蛋白的等電點(diǎn)在酪蛋白的等電點(diǎn)在pH3.8-5.4pH3.8-5.4之間之間n pH= pI pH= pI時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小n 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 取取7 7支支同樣規(guī)格同樣規(guī)格的干燥試管，精確加入各試劑的干燥試管，精確加入各試劑

8、試管號(hào)碼試管號(hào)碼1 12 23 34 45 56 67 7蒸餾水蒸餾水2.42.43.23.23.03.01.51.5 2.752.75 3.383.381.00M1.00M醋酸醋酸1.61.60.80.80.1M0.1M醋酸醋酸4.04.01.01.00.01M0.01M醋酸醋酸2.52.5 1.251.25 0.620.62pHpH3.53.53.83.84.14.14.74.75.35.35.65.65.95.9 酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定注：?jiǎn)挝痪鶠樽ⅲ簡(jiǎn)挝痪鶠閙L生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 向每個(gè)試管中各加向每個(gè)試管中各加0.5%0.5%酪蛋白溶液酪蛋

9、白溶液20滴滴， 加一管，立即混勻一管加一管，立即混勻一管 靜置靜置3030分鐘后，以分鐘后，以0 0、+ +、+、+、+表示各管的混濁度，并指出哪一種表示各管的混濁度，并指出哪一種pHpH是酪蛋是酪蛋白的等電點(diǎn)白的等電點(diǎn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1 12 23 34 45 56 67 7沉淀量沉淀量0 0+ +0 00 0n 酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定1234567實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論結(jié)論 2 2：n 4 4號(hào)號(hào)試管沉淀量最多試管沉淀量最多n 說(shuō)明說(shuō)明4 4號(hào)管溶液的號(hào)管溶液的pHpH值為酪蛋值為酪蛋白的等電點(diǎn)，即白的等電點(diǎn)，即pI=4.7pI=4.7生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)u 什么是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)？什么是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)？u 在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶液為什在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶液為什么容易發(fā)生沉淀？么容易發(fā)生沉淀？思考題思考題生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物