幾種基本蛋白質(zhì)試驗技術(shù)

1、 SDS-PAGE Western blotting Southwestern blotting Immunochemistry基本原理：根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同分離復雜蛋白質(zhì)成分。1.制備凝膠試劑： 丙烯酰胺（單體） 亞甲雙丙烯酰胺（膠聯(lián)劑） 二者比例29 ：1 母液濃度30% 過硫酸銨（引發(fā)劑） N,N,N,N-四甲基乙二胺（ TEMED） (加速劑) 十二烷基磺酸鈉（SDS）（陰離子變性劑）SDS-PAGE試劑2.蛋白上樣緩沖液3.電泳緩沖液 4.考馬斯亮藍R250染色液5.脫色液SDS-PAGE實驗過程流程如下： 凝膠制備凝膠制備 蛋白樣品制備及上樣蛋白樣品制備及上樣 電泳電泳 卸膠卸膠

2、染色染色 脫色脫色凝膠制備 梳子孔分離膠濃縮膠 分子量范圍(KDa) 凝膠濃度范圍 100 4%-7% 10-100K 8%-15% 10 20%-30%試劑及濃度 12%分離膠純水 4.9ml30%丙烯酰胺 6.0ml1.5M Tris-Cl（pH8.8） 3.8ml10%SDS 150ul10%過硫酸胺 150ulTEMED 4ul 試劑及濃度 5%濃縮膠純水 4.2ml30%丙烯酰胺 0.99ml1.0M Tris-Cl（pH6.8） 0.75ml10%SDS 60ul10%過硫酸胺 30ulTEMED 3ul每個加樣孔所上樣蛋白總量要適中每個加樣孔所上樣蛋白總量要適中 過高過高: :蛋

3、白條帶扭曲蛋白條帶扭曲 過低過低: :蛋白條帶染色淺蛋白條帶染色淺蛋白樣品需與上樣緩沖液混合蛋白樣品需與上樣緩沖液混合(1:1)(1:1) 2 2SDSSDS凝膠上樣緩沖液凝膠上樣緩沖液(100mM/L Tris-Cl(pH6.8)(100mM/L Tris-Cl(pH6.8)， 200mM/L DTT200mM/L DTT，4%SDS4%SDS，0.2%0.2%溴酚藍，溴酚藍，20% 20% 甘油甘油) )上樣前樣品需要沸煮上樣前樣品需要沸煮3-53-5分鐘分鐘 上層膠電壓小(80V) 使蛋白在濃縮膠和分離膠的交界處濃縮呈線狀 下層膠電壓加大(150V) 使蛋白樣品充分分開 基本原理基本原理

4、: 將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane)上,在膜上進行固相免疫化學染色,原位顯示蛋白質(zhì)帶,從而在已知分子量的基礎(chǔ)上對蛋白質(zhì)進行定性、定量分析。 SDS-PAGE（不經(jīng)染色） 電場轉(zhuǎn)移 免疫化學染色 切下需轉(zhuǎn)移凝膠，再剪下一塊與凝膠塊等大的硝酸纖維素膜和兩塊厚濾紙，均浸泡于電轉(zhuǎn)移緩沖液中（25mM Tris，192mM glycine，0.1%SDS，20%甲醇 ） 至少30分鐘。然后用塑料框架固定如“三明治”樣。凝膠NCM濾紙固定架（ ）（ + ） SDS-蛋白質(zhì)復合物在電場的作用下向正極移動，達到NCM，以共價鍵結(jié)合在NCM上。

5、根據(jù)目的蛋白分子量大小設定電流（恒流）或電壓（恒壓）大小。 凝膠、NCM 及濾紙一定要在電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡； 凝膠、NCM 及濾紙大小應一致，以防電轉(zhuǎn)時短路（半干轉(zhuǎn)時）； 一定要趕走“三明治”各層間的氣泡； 電轉(zhuǎn)移緩沖液中的甲醇（可促進蛋白質(zhì)與NCM的結(jié)合）最好用前加入。 轉(zhuǎn)移完成后，可用麗春紅染NCM,觀察轉(zhuǎn)移的效果；同時，轉(zhuǎn)膜后的凝膠也可以進行銀染或者考染，評價轉(zhuǎn)移的效果。 最好是NCM上可見，凝膠上模糊。 麗春紅染色NCM (2-DE)銀染轉(zhuǎn)膜后的凝膠（2-DE）試劑: TBS（100mmol Tris，150mmol Nacl） 復性液 (0.3% Triton X-100于TBS中)

6、 封閉液 (5%脫脂奶粉于TBS中) TBST漂洗液（0.05% TWeen-20于TBS中) 復性 把硝酸纖維素膜放入復性液中,復性5min后, Milli-Q水沖洗兩遍； 封閉 把復性過的硝酸纖維素膜放入封閉液，平放于搖床上室溫孵育1-2小時，或4放置過夜； 洗滌 棄去封閉液，用TBST洗滌3次, 10min/次； 一抗孵育 一抗與封閉液按比例混勻后,移至塑料袋中，將硝酸纖維素膜放入其中, 密封塑料袋, 于搖床上室溫溫育2小時； 洗滌 TBST充分34次,10min/次； 二抗孵育 將辣根過氧化物酶二抗用封閉液稀釋后, 將硝酸纖維素膜加入其中,室溫搖床上放置2小時； 洗滌 TBST充分34

7、次,10min/次； DAB顯色 將二抗孵育后的硝酸纖維素膜放入顯色液中,輕輕搖動310min,待膜上可見明顯的顯色斑點。 該方法是結(jié)合了Western blotting和southern blotting兩種試驗方法而發(fā)展起來的檢測與特異DNA序列相結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白的方法.基本原理: 細胞核蛋白提取物經(jīng)SDS-PAGE后,轉(zhuǎn)移至NCM上,然后用標記的DNA探針檢測轉(zhuǎn)移至膜上的蛋白質(zhì)。 SDS-PAGE 電場轉(zhuǎn)移 標記的DNA探針與NCM上蛋白質(zhì)的雜交基本原理： 應用抗原與抗體結(jié)合的免疫學原理，檢測細胞或組織中多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。 組織固定、石蠟包埋、切片、脫蠟 過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶 微波修復抗原 封閉 一抗、二抗孵育孵育 DAB顯色 蘇木素伊紅（HE）復染免疫組化法一般實驗過程 蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學概念 雙向