細(xì)菌發(fā)酵制藥

1、LOGOEdit your company slogan學(xué)習(xí)情境一學(xué)習(xí)情境一細(xì)菌發(fā)酵制藥細(xì)菌發(fā)酵制藥發(fā)發(fā) 酵酵 制制 藥藥LOGOEdit your company slogan子學(xué)習(xí)情境子學(xué)習(xí)情境1.1天冬酰胺酶發(fā)酵天冬酰胺酶發(fā)酵LOGO天冬酰胺酶生產(chǎn)的工藝流程天冬酰胺酶生產(chǎn)的工藝流程 LOGO任務(wù)任務(wù)1 1 菌種保藏菌種保藏任務(wù)任務(wù)2 菌種復(fù)壯菌種復(fù)壯任務(wù)任務(wù)3 種子擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)任務(wù)任務(wù)4 發(fā)酵罐的使用和維護(hù)發(fā)酵罐的使用和維護(hù)任務(wù)任務(wù)5 發(fā)酵控制、分離純化及活性測(cè)定發(fā)酵控制、分離純化及活性測(cè)定子學(xué)習(xí)情境子學(xué)習(xí)情境1 天冬酰胺酶發(fā)酵天冬酰胺酶發(fā)酵LOGO任務(wù)任務(wù)1 1 菌種保藏菌種保

2、藏LOGO一、菌種保藏的目的一、菌種保藏的目的 保持菌種的存活率與優(yōu)良遺傳性狀保持菌種的存活率與優(yōu)良遺傳性狀 ； 防止菌種退化與污染 使已經(jīng)退化的菌種恢復(fù)原有的性狀 總之，就是防止優(yōu)良遺傳性狀的喪失和菌種死亡。 LOGO二、菌種保藏的原理二、菌種保藏的原理 挑選典型培養(yǎng)物（挑選典型培養(yǎng)物（typical culturetypical culture）的優(yōu)良純種，）的優(yōu)良純種，并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件，使微生物處于并創(chuàng)造最有利于休眠的環(huán)境條件，使微生物處于代謝不活潑、代謝不活潑、生長(zhǎng)受抑制的休眠狀態(tài)。生長(zhǎng)受抑制的休眠狀態(tài)。 菌種的保藏主要是依據(jù)微生物的生理、生化特性，人工創(chuàng)造條件使微生物代謝

3、活動(dòng)處于不活潑狀態(tài)。利用微生物的孢子、芽孢及營(yíng)養(yǎng)體，給以不適合其萌發(fā)、生長(zhǎng)、繁殖的條件，即低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)等手段來(lái)達(dá)到菌種保藏的目的。 LOGO三、菌種的保藏方法三、菌種的保藏方法 斜面保藏法 沙土保藏法 冷凍真空干燥保藏法 試管熔封保藏法 礦油保存法 LOGO（一）斜面保藏法（一）斜面保藏法 1、貼標(biāo)簽：將注有菌株名稱和接種日期的標(biāo)簽貼在試管斜面正上方。 2、接種：將待藏菌種用些面接種法移種至標(biāo)明菌名的相應(yīng)試管斜面上。 3、培養(yǎng)：細(xì)菌置37恒溫培養(yǎng)1524h，酵母菌置2830恒溫培養(yǎng)3660h，放線菌和絲狀真菌置28培養(yǎng)47d。 4、收藏：為防止棉塞受潮長(zhǎng)雜菌，管口棉花應(yīng)用牛皮紙包扎

4、或用熔化的固體石蠟熔封棉塞后置4冰箱保存。保存溫度不宜太低，否則會(huì)因結(jié)冰脫水而加速菌種的死亡。斜面菌種LOGO（二）沙土管或硅膠管保藏法（二）沙土管或硅膠管保藏法1、處理沙土：取河沙經(jīng)60目篩子過(guò)篩以除去大的顆粒，用10%HCL浸泡（用量以浸沒(méi)沙面為度）24h（或煮沸30min）以除去有機(jī)質(zhì)，然后倒去鹽酸，用流水沖洗至中性，烘干或曬干備用。另取非耕作層瘦黃土（不含有機(jī)質(zhì)）風(fēng)干、粉碎，用100120目的篩子過(guò)篩備用。2、裝沙土管：將沙與土按2：1或4：1（W/W）比例混合均勻，裝入試管（10mm100 mm）中，裝置約1cm高，加棉塞后用高壓蒸汽滅菌（121滅菌30min）。滅菌后取少許置于牛肉

5、膏蛋白胨或麥芽汁培養(yǎng)液中，在合適的溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間確證無(wú)菌生長(zhǎng)才能使用。3、制備菌液：吸3ml無(wú)菌水至斜面菌種管內(nèi)，用接種環(huán)輕輕攪動(dòng)，洗一下孢子制成孢子懸液。4、加孢子液：吸取上述孢子液0.10.5ml于每一沙土管中，加入量以濕潤(rùn)沙土達(dá)2/3高度為宜。5、干燥：將含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器內(nèi)用培養(yǎng)皿盛P2O5（或變色硅膠）做干燥劑，再用真空泵抽氣24h以加速干燥。6、收藏：沙土管可選擇下列方法之一。保藏于干燥器中。將沙土管取出，管口用火焰熔封后保藏。將沙土管裝入含CaCl2等干燥劑的大試管內(nèi)，塞上橡皮塞并用蠟封管口，置于4冰箱中保藏。7、恢復(fù)培養(yǎng)：使用時(shí)挑少量混有孢子的沙土接種于斜面培

6、養(yǎng)基上即可。沙土管仍可原法繼續(xù)保藏。LOGO（三）冷凍真空干燥保藏法（三）冷凍真空干燥保藏法分支管再與麥?zhǔn)险婵沼?jì)和冷凝管相連。冷凝管的另一端連接在真空泵上。置冷凝管于盛有干冰（固體CO2）的廣口保溫瓶中，使安瓿管中抽出的水汽進(jìn)入冷凝管內(nèi)立刻凍結(jié)。將安瓿管的下半部也埋入干冰中，使管內(nèi)物質(zhì)驟然冷卻。約10min，管內(nèi)物質(zhì)已全部?jī)鼋Y(jié)，開動(dòng)真空泵30min后，將安瓿管移入-15的冰鹽水中，繼續(xù)開動(dòng)真空泵抽氣1h，然后將安瓿管置于室溫中，再抽氣30min。此時(shí)管內(nèi)物質(zhì)已全部干燥，樣品呈疏松狀。用微型煤氣燈在真空狀態(tài)下，熔封安瓿管的頸部。將制好的冷凍菌種管置于4冰箱中保藏。 先將牛奶煮沸后冷卻，去掉上面的

7、一層脂肪。反復(fù)三次后用脫脂棉過(guò)濾，或者將牛奶在3000r/min的離心機(jī)中離心數(shù)分鐘，除去表面脂肪后，在50kPa壓力下滅菌30min。然后用牛奶洗下在斜面上長(zhǎng)好的菌體，制成菌懸液，裝入安瓿管中約0.1ml，塞上棉塞，用橡皮管將安瓿管連接在分支管上（見圖1-1）圖1-1 冷凍干燥封管裝置簡(jiǎn)圖1、安瓿管 2、干冰容器 3、接真空計(jì) 4、接真空泵 5、冷凝管LOGO（四）試管熔封（密封）保藏法（四）試管熔封（密封）保藏法試管熔封法的一般操作如下：用各種瓊脂斜面（普通肉湯等）常規(guī)滅菌后，經(jīng)接種，室溫培養(yǎng)2448小時(shí)后，將接種菌生長(zhǎng)旺盛的試管用噴燈將其管口熔封，分別置室溫和冰箱下保存。使用時(shí)，用砂輪在

8、管口劃一圈，并在乙醇燈下火焰滅菌后敲開管口即可轉(zhuǎn)接到另一斜面上，由于試管經(jīng)熔封后，可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又可減緩細(xì)菌的代謝速度，并能防止雜菌污染。密封法保藏法將需保藏菌種按無(wú)菌操作要求接種至固體培養(yǎng)基（細(xì)菌采用肉湯瓊脂、酵母采用蔡氏培養(yǎng)基、放線菌采用高氏號(hào)培養(yǎng)基）上，經(jīng)適溫培養(yǎng)后，（細(xì)菌d，孢芽菌、放線菌d，酵母菌d）塞緊棉花塞，放在干燥器內(nèi)，干燥器密封處涂上凡士林。蓋緊后使之與真空泵相連接，開動(dòng)真空泵抽真空30rain至h（此時(shí)真空度約為640），關(guān)閉密封口，拔出膠塞，置于室溫下保存，待使用時(shí)，打開蓋，取出菌種，接種至培養(yǎng)基上即可 。LOGO（五）礦油保存法（五）礦油保存法 菌種在瓊脂斜面上

9、或在半固體瓊脂試管中生長(zhǎng)后，在試管中再加入無(wú)菌液體石蠟，使覆蓋在培養(yǎng)基上面，這樣就使菌種和培養(yǎng)基與外界空氣隔絕，并可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，管口可用固體石蠟封口，放置低溫保存，至少可以保存六個(gè)月至一年）。 LOGO表表1-1 菌種保藏各種方法比較表菌種保藏各種方法比較表LOGO表表1-2微生物菌種制備、保藏和使用記錄表微生物菌種制備、保藏和使用記錄表LOGO表表1-3 菌種接收記錄表菌種接收記錄表LOGO任務(wù)任務(wù)2菌種復(fù)壯菌種復(fù)壯LOGO菌種合理傳代方法之一菌種合理傳代方法之一LOGO一、菌種的衰退、復(fù)壯概念一、菌種的衰退、復(fù)壯概念1.衰退（degeneration） ：菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由

10、于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。衰退的原因：基因突變，分離現(xiàn)象。常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等；代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降。2、菌種的復(fù)壯（rejuvenation）：使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀。狹義的復(fù)壯是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施；廣義的復(fù)壯是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用

11、自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種。 LOGO二、菌種復(fù)壯的主要方法二、菌種復(fù)壯的主要方法 純種分離法 宿主體內(nèi)復(fù)壯法 淘汰法 遺傳育種法 菌種保藏方法 LOGO純種分離法純種分離法平板表面涂布法平板表面涂布法平板劃線分離法平板劃線分離法瓊脂培養(yǎng)基澆注法瓊脂培養(yǎng)基澆注法用用“分離小室分離小室”進(jìn)行單細(xì)胞分離進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離用顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離用菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離用菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離菌落純菌落純（菌種純）（菌種純）細(xì)胞純細(xì)胞純（菌株純）（菌株純）純種分離法純種分離法LOGO平板涂布方法LOGO平板劃線方法平板劃線方法LOGO三、菌種復(fù)壯操作步驟三

12、、菌種復(fù)壯操作步驟1、菌懸液的制備。用無(wú)菌生理鹽水或緩沖液將斜面菌體洗下制成菌懸液。經(jīng)一定濃度稀釋后在平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。 2、平板分離。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，定量稀釋后制成菌濃度為每毫升50-200個(gè)的菌懸液，取0.1毫升注入平皿，再倒入適量培養(yǎng)基，搖勻，制成混菌平板，培養(yǎng)后長(zhǎng)出 分離的單菌落。3、純培養(yǎng)。選取分離培養(yǎng)后長(zhǎng)出的各型單菌落，接種斜面后培養(yǎng)。4、初篩。將成熟的斜面菌種對(duì)應(yīng)接入發(fā)酵瓶，搖床發(fā)酵一段時(shí)間后測(cè)定各菌落生產(chǎn)性能。5、復(fù)篩。挑選初篩中高單位菌株的5%20%進(jìn)行搖瓶復(fù)試，最好使用母瓶與發(fā)酵瓶二級(jí)發(fā)酵，重復(fù)35次后分析確定產(chǎn)量水平。初、復(fù)篩都需以正常生產(chǎn)菌種作對(duì)照，復(fù)篩出的菌株產(chǎn)量應(yīng)比

13、對(duì)照菌株提高5%以上，并經(jīng)糖、氨代謝檢驗(yàn)，合格后在生產(chǎn)罐上試驗(yàn)。 6、菌種保藏。將復(fù)篩后得到的高單位菌株制成沙土管、冷凍管或用其他方法保藏。LOGO任務(wù)任務(wù)3 種子擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)LOGO 種子擴(kuò)大培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。 發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的種子的必須滿足以下條件： （1）菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，遲緩期短； （2）生理形狀穩(wěn)定； （3）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求； （4）無(wú)雜菌污染； （5）保持

14、穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 LOGO一、種子的制備過(guò)程一、種子的制備過(guò)程種子擴(kuò)大培養(yǎng)流程圖LOGO1、實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌種子的制備、實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌種子的制備 細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為12天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要510天。 (1)菌種培養(yǎng)：采取大腸桿菌ASl-375。普通牛肉培養(yǎng)基，接種后于37培養(yǎng)24h。(2)種子培養(yǎng)。16%玉米漿，接種量1%一1.5%，37溫度，通氣攪拌培養(yǎng)48h。 其過(guò)程如下： 試管三角瓶搖床種子罐 LOGO液體培養(yǎng)法（三角瓶搖床振蕩或轉(zhuǎn)式培養(yǎng)）液體培養(yǎng)法（三角瓶搖床振蕩或轉(zhuǎn)式培養(yǎng)）LOGO2、生產(chǎn)車間種子制備、生產(chǎn)車間種子制

15、備 種子罐的作用： 主要是使菌體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。 種子罐級(jí)數(shù)的確定 種子罐級(jí)數(shù)種子罐級(jí)數(shù)：是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于： 菌種生長(zhǎng)特性、菌體繁殖速度； 所采用發(fā)酵罐的容積。 細(xì)菌細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 LOGO3、確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題、確定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問(wèn)題 種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì) 種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會(huì) 雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子

16、發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。 LOGO二、種子質(zhì)量的控制二、種子質(zhì)量的控制 (一一)影響孢子質(zhì)量的因素及控制影響孢子質(zhì)量的因素及控制 影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間等。間和冷藏時(shí)間等。 1 、培養(yǎng)基培養(yǎng)基 （1）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用；）培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)合格才可使用； （2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量； （3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間；）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定時(shí)間； （4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比

17、較單一的氮源，作為）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。 LOGO2、種齡與接種量、種齡與接種量 種齡種齡：種子培養(yǎng)時(shí)間。 一般選擇對(duì)數(shù)期，縮短發(fā)酵周期。 接種量接種量：移入的種子液體積與接種后培養(yǎng)液體積比。 多數(shù)抗生素的接種量在7%-15%，有時(shí)20-25%。依據(jù)具 體的發(fā)酵類型和工藝條件而定。3、溫度：、溫度： 溫度直接影響生長(zhǎng)和酶的合成；最適溫度最適溫度。LOGO 4、pH值：對(duì)微生物有明顯的影響各種微生物都有生長(zhǎng)的最適pH。培養(yǎng)基pH值在發(fā)酵時(shí)要受菌體代謝的影響。調(diào)節(jié)方法調(diào)節(jié)方法 (1) 酸

18、堿溶液中和 (2) 緩沖溶液 (3) 生理緩沖劑LOGO 5、通氣攪拌攪拌：攪拌： 促進(jìn)氧的溶解，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的分散。 通氣：通氣： 通氣量的多少以溶解氧溶解氧來(lái)衡定。LOGO 6、泡沫危害危害： 影響微生物對(duì)氧的吸收。消泡方法：（1） 消泡劑：天然動(dòng)植物油、石油化工礦物油；改性油，表面活性劑（有機(jī)硅聚合物）；（2） 機(jī)械消泡：（3）改變培養(yǎng)基成分。LOGO 7、染菌的控制 染菌原因染菌原因： 設(shè)備、管道、閥門漏損、發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)“死角”、滅滅菌不徹底菌不徹底、空氣凈化不好、無(wú)菌操作不嚴(yán)無(wú)菌操作不嚴(yán)、菌種不純； 8、種子罐級(jí)數(shù) 種子罐級(jí)數(shù)越少，越有利于簡(jiǎn)化工藝，便于控制，減少染菌。LOGO任

19、務(wù)任務(wù)4 發(fā)酵罐的使用和維護(hù)發(fā)酵罐的使用和維護(hù)LOGO一、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)一、發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)1、空氣預(yù)處理器 2、電動(dòng)閥 3、電磁流量計(jì) 4、空氣預(yù)濾器 5、空氣精濾器 6、蒸汽過(guò)濾器 7、pH 電極 8、電動(dòng)閥（夾套進(jìn)冷水） 9、電動(dòng)閥（夾套進(jìn)熱水） 10、通風(fēng)管 11、消沫電極 12、消沫器 13、攪拌器 14、檢測(cè)溫度的電熱偶 15、DO電極 16擋板 17電機(jī) 18、減速器 19、接種孔 20、出水閥 21、夾套 22、冷凝水排除閥 23、取樣與放料閥（三向閥門）圖1-6 100L全自動(dòng)實(shí)驗(yàn)罐結(jié)構(gòu)示意圖LOGO二、發(fā)酵罐的使用二、發(fā)酵罐的使用 （一）空氣過(guò)濾器的滅菌操作 1、滅菌前的準(zhǔn)備 啟

20、動(dòng)蒸汽發(fā)生器 將自來(lái)水引入水處理裝置進(jìn)行除雜、軟化處理，處理后留入貯水灌，然后開啟自動(dòng)控制開關(guān)進(jìn)行加熱，蒸汽壓力達(dá)到0.2-0.3Mpa時(shí)可供使用。 啟動(dòng)冷凍機(jī) 將自來(lái)水引入冷凍機(jī)，開啟冷水機(jī)電源開關(guān)制冷。當(dāng)冷水溫度達(dá)到10時(shí)，可供空氣預(yù)處理使用。 啟動(dòng)空氣壓縮機(jī) 啟動(dòng)前，先關(guān)閉空氣管路上所有閥門，然后打開空氣壓縮機(jī)電源開關(guān)，啟動(dòng)空氣壓縮機(jī)。當(dāng)空氣壓縮機(jī)的壓力達(dá)到0.25Mpa左右時(shí)，依次打開管路上閥門，將空氣引入冷凍機(jī)、油水分離器，經(jīng)過(guò)冷卻、除油水后進(jìn)入貯氣罐，待用。LOGO2、空氣過(guò)濾器的滅菌、吹干以及保壓、空氣過(guò)濾器的滅菌、吹干以及保壓圖1-7是100L發(fā)酵罐空氣管道示意圖1、電動(dòng)閥 2

21、、電磁流量計(jì) 3、粗濾器 4、空氣閥門 5、排氣閥1 6、壓力表 7、精濾器 8、排氣閥2 9、空氣閥門 10、排氣閥311、蒸汽閥1 12、空氣過(guò)濾器 13、蒸汽閥2 14排氣閥4LOGO（二）發(fā)酵罐的空消（二）發(fā)酵罐的空消 發(fā)酵罐空消前，必須首先檢查并關(guān)閉發(fā)酵罐夾套的進(jìn)水閥門，然后啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，按照操作程序進(jìn)入到顯示發(fā)酵罐溫度的界面，以便觀察溫度變化。 空消時(shí)，先打開夾套的冷凝水排出閥，以便夾套中殘留的水排出，然后從兩路管道將蒸汽引入發(fā)酵罐：一路是發(fā)酵罐的通風(fēng)管，另一路是發(fā)酵罐的放料管。每一路進(jìn)蒸汽時(shí)，都是按照“由遠(yuǎn)處到近處”依次打開各個(gè)閥門。兩路蒸汽都進(jìn)入發(fā)酵罐后，適當(dāng)打開所有能夠排汽的閥

22、門充分排汽，如管路上的小排汽閥、取樣閥、發(fā)酵罐的排氣閥等，以便消除滅菌的死角。滅菌過(guò)程中，密切注意發(fā)酵罐溫度以及壓力的變化情況，及時(shí)調(diào)節(jié)各個(gè)進(jìn)蒸汽閥門以及各個(gè)排汽閥門的開度，確保滅菌溫度在（1211），維持30min，即可達(dá)到滅菌效果。滅菌完畢，先關(guān)閉各個(gè)小排汽閥，然后按照“由近處到遠(yuǎn)處”依次關(guān)閉兩路管道上各個(gè)閥門。待罐壓降至0.05Mpa左右時(shí)，關(guān)閉發(fā)酵罐的排氣閥，迅速打開精過(guò)濾器后的空氣閥，將無(wú)菌空氣引入發(fā)酵罐，利用無(wú)菌空氣壓力將管內(nèi)的冷凝水從放料閥排出。最后，關(guān)閉放料閥，適當(dāng)打開發(fā)酵罐的排氣閥，并調(diào)節(jié)進(jìn)空氣閥門開度，使罐壓維持在0.1Mpa左右，保壓，備用。LOGO（三）培養(yǎng)基的實(shí)消（三

23、）培養(yǎng)基的實(shí)消 培養(yǎng)基實(shí)消前，關(guān)閉進(jìn)空氣閥門并打開發(fā)酵罐的排氣閥，排出發(fā)酵罐內(nèi)空氣，使罐壓為0，再次檢查并關(guān)閉發(fā)酵罐夾套的進(jìn)水閥門、發(fā)酵罐放料閥。將事先校正好的pH電極、DO電極以及消沫電極等插進(jìn)發(fā)酵罐，并密封、固定好。然后，擰開接種孔的不銹鋼塞，將配制好的培養(yǎng)基從接種孔倒入發(fā)酵罐。啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，按照操作程序進(jìn)入到顯示溫度、pH、DO、轉(zhuǎn)速等參數(shù)的界面，以便觀察各種參數(shù)的變化。同時(shí)，啟動(dòng)攪拌，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為100r/min左右。 LOGO 實(shí)消時(shí)，先打開夾套的進(jìn)蒸汽閥以及冷凝水排出閥，利用夾套蒸汽間接加熱，至80左右，為了節(jié)約蒸汽，可關(guān)閉夾套的進(jìn)蒸汽閥，但必須保留冷凝水排出閥處于打開狀態(tài)。然后，按照

24、空消的操作，從通風(fēng)管和放料管兩路進(jìn)蒸汽直接加熱培養(yǎng)基。實(shí)消過(guò)程中，所有能夠排汽的閥門應(yīng)適當(dāng)打開并充分排汽，根據(jù)溫度變化及時(shí)調(diào)節(jié)各個(gè)進(jìn)蒸汽閥門以及各個(gè)排汽閥門的開度，確保滅菌溫度和滅菌時(shí)間達(dá)到滅菌要求（不同培養(yǎng)基滅菌要求不一樣）。 LOGO 滅菌完畢，先關(guān)閉各個(gè)小排汽閥，然后關(guān)閉放料閥，并按照“由近處到遠(yuǎn)處”依次關(guān)閉兩路管道上各個(gè)閥門。待罐壓降至0.05Mpa左右時(shí)，迅速打開精過(guò)濾器后的空氣閥，將無(wú)菌空氣引入發(fā)酵罐，調(diào)節(jié)進(jìn)空氣閥門以及發(fā)酵罐排氣閥的開度，使罐壓維持在0.1Mpa左右，進(jìn)行保壓。最后，關(guān)閉夾套冷凝水排除閥，打開夾套進(jìn)冷卻水閥門以及夾套出水閥，進(jìn)冷卻水降溫，這時(shí)，啟動(dòng)冷卻水降溫自動(dòng)控

25、制，當(dāng)溫度降低至設(shè)定值機(jī)自動(dòng)停止進(jìn)水。自始至終，攪拌轉(zhuǎn)速保持為100r/min左右，無(wú)菌空氣保壓為0.1Mpa左右，降溫完畢，備用。LOGO（四）接種操作（四）接種操作 接種前，調(diào)節(jié)進(jìn)空氣閥門以及發(fā)酵罐排氣閥門的開度，使罐壓為0.01-0.02Mpa。 用酒精棉球圍繞接種孔并點(diǎn)燃。在酒精火焰區(qū)域內(nèi)，用鐵鉗擰開接種孔的不銹鋼塞，同時(shí)，迅速解開搖瓶種子的紗布，將種子液倒入發(fā)酵罐內(nèi)。 接種后，用鐵鉗去不銹鋼塞在火焰上灼燒片刻，然后迅速蓋在接種孔上并擰緊。 最后，將發(fā)酵罐的進(jìn)氣以及排氣的手動(dòng)閥門開大，在計(jì)算機(jī)上設(shè)定發(fā)酵初始通氣量以及罐壓，通過(guò)電動(dòng)閥門控制發(fā)酵通氣量以及罐壓，使達(dá)到控制要求。 LOGO（

26、五）發(fā)酵過(guò)程的操作（五）發(fā)酵過(guò)程的操作參數(shù)控制 發(fā)酵過(guò)程中在線檢測(cè)參數(shù)可通過(guò)計(jì)算機(jī)顯示，通氣量、pH、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和罐壓等許多參數(shù)，可按照控制軟件的操作程序進(jìn)行設(shè)定，只要調(diào)解機(jī)構(gòu)在線，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制調(diào)解機(jī)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)在線控制。 流加控制 流加時(shí)，在火焰區(qū)域內(nèi)揭開不銹鋼插針的包扎，并將插針迅速插穿流加孔的硅膠塞，同時(shí)，將硅膠罐裝入蠕動(dòng)泵的擠壓輪中，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，積壓輪轉(zhuǎn)動(dòng)可以將流加液壓進(jìn)發(fā)酵罐。通過(guò)計(jì)算機(jī)可以設(shè)定開始流加的時(shí)間、擠壓輪的轉(zhuǎn)速，從而可以自動(dòng)流加以及自動(dòng)控制流加速度。 取樣操作 取樣時(shí)，可調(diào)節(jié)罐底的三向閥門至取樣位置，利用發(fā)酵罐內(nèi)壓力排出發(fā)酵液，用試管或燒杯接收。取樣完畢，關(guān)閉三向閥門，

27、打開與之連接的蒸汽，對(duì)取樣口滅菌幾分鐘。放料操作 發(fā)酵結(jié)束后，先停止攪拌，然后，關(guān)閉發(fā)酵罐的排氣閥門，調(diào)節(jié)罐底的三向閥門至放料位置，利用發(fā)酵罐內(nèi)壓力排出發(fā)酵液，用容器接受發(fā)酵液。LOGO（六）發(fā)酵罐的清洗與維護(hù)（六）發(fā)酵罐的清洗與維護(hù) 放料結(jié)束后，先關(guān)閉放料閥以及發(fā)酵罐進(jìn)空氣閥門，打開排氣閥門派出館內(nèi)空氣，使罐壓為0。然后，拆卸安裝在罐上的pH、DO等電極以及流加孔上的不銹鋼插針，并在電極插空和流加孔擰上不銹鋼塞。接著，從接種孔加入70L左右的清水，啟動(dòng)攪拌，轉(zhuǎn)速為100r/min左右，用蒸汽加熱清水至121左右，攪拌30min左右，以此清洗發(fā)酵罐。清洗完畢，利用空氣壓力排出洗水，并用空氣吹干

28、發(fā)酵罐。 停用蒸汽時(shí)，切斷蒸汽發(fā)生器的電源，通過(guò)發(fā)酵罐的各個(gè)蒸汽管道的排氣閥排出殘余蒸汽，直至蒸汽發(fā)生器上的壓力表現(xiàn)是為0。停用空氣時(shí)，切斷空氣壓縮機(jī)的電源，通過(guò)空氣管道的排氣閥排出殘余空氣，直至貯氣罐上壓力表顯示為0。最后，關(guān)閉所有的閥門以及計(jì)算機(jī)。LOGO（七）電極的使用與維護(hù)（七）電極的使用與維護(hù)pH電極的使用與維護(hù) 在pH電機(jī)裝上發(fā)酵罐之前，須對(duì)pH電極進(jìn)行兩點(diǎn)校正。pH電極與計(jì)算機(jī)連接后接通電源，將pH電極分別浸泡在兩種不同pH的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中進(jìn)行校正，檢查測(cè)定值的兩點(diǎn)斜率，一般要求斜率90%，方可使用。 DO的電極的使用與維護(hù) 使用前，DO電極與計(jì)算機(jī)連接并接通電源，將DO電極浸泡

29、在飽和的亞硫酸鈉溶液中（或培養(yǎng)基恒溫結(jié)束降溫前），此時(shí)的測(cè)量指標(biāo)定為0。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌并冷卻至初始發(fā)酵溫度充分通風(fēng)攪拌（一般以發(fā)酵過(guò)程的最大通風(fēng)和攪拌轉(zhuǎn)速條件下氧飽和）時(shí)，DO電極的測(cè)量指標(biāo)定為100%。LOGO（八）折疊膜過(guò)濾芯的維護(hù)（八）折疊膜過(guò)濾芯的維護(hù) 折疊膜過(guò)濾芯，其鎖扣、外筒、端蓋以及密封膠圈雖然都是熱穩(wěn)定材料，但耐高溫有一定限度。滅菌時(shí)，必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和滅菌時(shí)間，若滅菌溫度過(guò)高、滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易造成損壞。同時(shí)，滅菌后必須用空氣吹干，才能使用，否則過(guò)濾效率降低或失效。不使用時(shí)，必須保持干燥，以免霉腐。 LOGO（九）蒸汽發(fā)生器的維護(hù)（九）蒸汽發(fā)生器的維護(hù) 用于蒸汽發(fā)生器的水必須經(jīng)過(guò)軟化、除雜等處理，以免蒸汽發(fā)生器加熱管結(jié)垢，影響產(chǎn)生蒸汽的