細(xì)胞原生質(zhì)體的分離與融合

1、實(shí)驗(yàn)九 植物原生質(zhì)體分離及融合一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體的分離及融合的原理，掌握其操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 植物原生質(zhì)體是具有質(zhì)膜，但去掉了細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，分離的原生質(zhì)體在培養(yǎng)條件下具有再生新壁，進(jìn)行連續(xù)的細(xì)胞分裂并分化成完整植株的能力，即具有細(xì)胞全能性。細(xì)胞壁的主要成份是纖維素和果膠質(zhì)，它們分別經(jīng)纖維素酶，果膠酶處理即可分解，從而脫去細(xì)胞壁。由于質(zhì)膜完全暴露，原生質(zhì)體具有攝取大分子(如核酸)，細(xì)胞器(如核、葉綠體)和細(xì)菌，病毒的能力，因此是進(jìn)行遺傳操作，基因轉(zhuǎn)移的好材料。而原生質(zhì)體融合是實(shí)現(xiàn)上述目的的一個(gè)極為重要的手段。同種或異種原生質(zhì)體可在聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)

2、下產(chǎn)生異核體，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞雜交，實(shí)現(xiàn)廣泛的遺傳重組，創(chuàng)造新的生物類型。PEGPEG為為一種高分子化合物，能與水、蛋白質(zhì)、和一種高分子化合物，能與水、蛋白質(zhì)、和碳水化合碳水化合物等物等一些基團(tuán)能形成氫鍵一些基團(tuán)能形成氫鍵。普遍。普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能改變認(rèn)為聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類脂類分子發(fā)分子發(fā)生疏散和重組，由于生疏散和重組，由于兩細(xì)胞兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力和以及彼此的表面張力作用，從而作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合使細(xì)胞發(fā)生融合聚乙二醇（PEG）由于含有醚鍵而具有負(fù)極

3、性，與水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等一些正極化基團(tuán)能形成氫鍵，當(dāng)聚乙二醇（PEG）分子足夠長(zhǎng)時(shí)，可作為臨近原生質(zhì)表面之間的分子橋而使之粘連、聚乙二醇（PEG）也能連接鈣等陽(yáng)離子，鈣可在一些負(fù)極化基團(tuán)和聚乙二醇（PEG）之間形成橋，因而促進(jìn)粘連。從而引起原生質(zhì)體融合：高鈣高pH由于增加了質(zhì)膜的流動(dòng)性，因而也大大提高了融合頻率，洗滌時(shí)滲透壓沖擊也可能起作用。三、實(shí)驗(yàn)用品三、實(shí)驗(yàn)用品 (一)材料：植物葉片(菠菜葉片) (二)用具：倒置顯微鏡，離心機(jī)，過(guò)濾篩(100目)，漏斗，燒杯，吸管，長(zhǎng)注針，注射器(5-10m1)等； (三)試劑： 1纖維素酶2，果膠酶l。 在0.65M甘露醇，0.05MCaCl22H

4、20和0.1MES中，PH調(diào)至5.6-6.0。 20.16M CaCl22H20溶液(內(nèi)含0.1MES)PH5.6。 322蔗糖溶液。 430聚乙二醇(PEG)溶液 5高PH高鈣洗脫液(PH=9) 0.1M CaCl22H20 0.1M梨酶醇 0.5ml100ml 1M Tris 60.24M CaCl22H20四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法 (一)原生質(zhì)體的分離收集： 1取菠菜葉片撕去下表皮，每小組稱0.2g切成小塊放到10ml酶液中，在26下酶解4-5小時(shí)，或酶含量減半過(guò)夜，期間輕輕搖動(dòng)幾次。 2用100目的過(guò)濾篩過(guò)濾。 3用與濾液等體積的0.16M CaCl22H20溶液沖洗過(guò)濾篩，使沖洗液沖

5、入過(guò)濾液。 4濾液用離心機(jī)100-300rpm，離心5分鐘棄上清。 5沉淀中加入0.16M CaCl22H20溶液1-2ml于沉淀，輕搖使之懸浮，用帶長(zhǎng)針頭的注射器自離心管底部輕輕地加入6-8ml 22蔗糖溶液，使之形成界面。6靜置待原生質(zhì)體形成一條帶時(shí)棄去上、下液及殘?jiān)?，用吸管吸取收集原生質(zhì)體。蔗糖漂浮方法： 1）用細(xì)口吸管吸22%蔗糖溶液約3ml，小心插入盛有原生質(zhì)體懸液的離心管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質(zhì)體懸液中間有一明顯界面(注意要有明顯界面). 2靜置后此時(shí)死細(xì)胞及碎片降至蔗糖溶液內(nèi)，聚集在離心管底部，而活細(xì)胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面處， 3) 用細(xì)管吸取漂浮在上下界面處的健康原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)入干凈的離心管中7用0.24M CaCl22H20溶液洗滌一次，離心吸去上清液。8沉淀中加入l-2mlO.16MCaCl22H20溶液懸浮沉淀，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使原生質(zhì)體密度為2105個(gè)ml。9取一滴于載玻片上，低倍鏡觀察原生質(zhì)體的純度和完整性，也可用熒光顯微鏡檢查。 (二)原生質(zhì)體融合操作 1取上述原生質(zhì)體液兩滴，間隔5mm滴