生物化學(xué)知識點(diǎn)

1、一名詞解釋吸光度 是指光線通過溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度 與該光線通過溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度比值的對數(shù)，影響它的因素有溶劑、濃度、溫度等等。吸光度用A表示。Aabc，其中a為吸光系數(shù)，單位L/(g·cm),b為液層厚度（通常為比色皿的厚度），單位cm ， c為溶液濃度，單位g/L鹽析 當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。調(diào)整保留時間：氣相色譜中,扣除死時間后的保留時間。t'RtRt0tR：進(jìn)樣開始至出某組分峰所需時間，稱保留時間t0：進(jìn)樣開始至出空氣峰所需時間，稱死時間外標(biāo)法 就是用標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積或峰

2、高與其對應(yīng)的濃度做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,測出樣品的峰面積或峰高,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的濃度,這是最常用的一種定量方法泳動度 指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度中泳動的速度。也稱遷移率。單克隆抗體 免疫動物的脾細(xì)胞能產(chǎn)生相應(yīng)的特異抗體，從中能選出單個細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，即可得到對應(yīng)于一個抗原決定簇的單一抗體分子，即單克隆抗體。序列標(biāo)簽位點(diǎn) 是在染色體上定位明確，且可用PCR擴(kuò)增的單拷貝序列。定向克?。菏雇庠碊NA片段定向插入到載體分子中的方案叫定向克隆。比較基因組學(xué):在基因組圖譜和序列分析的基礎(chǔ)上，對已知基因組進(jìn)行比較，了解基因的功能，表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。摩爾吸光系數(shù)：是指在一定波長時，溶液濃度為1mol/

3、L，厚度為1cm的吸光度，用或EM表示分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值 K=固定相中溶質(zhì)的濃度/流動相中溶質(zhì)的濃度反離子 粘粒吸附?jīng)Q定電位離子層帶電后，靠靜電引力吸引溶液中電性相反的離子聚其周圍，這部分離子稱反離子，形成反離子層。cDNA文庫：將真核細(xì)胞內(nèi)全部mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA并將雙鏈cDNA（dscDNA）和載體連接，由此得到的cDNA克隆群體稱為cDNA文庫。包含體：它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚體，包含大部分的表達(dá)蛋白。 以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集，形成包含體。 相對離心力：是指顆粒所受的

4、離心力與地心引力（重力）之比。 即RCF=Fc/Fg概述結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究工作的基本步驟 繪制染色體的低分辨率遺傳圖譜和物理圖譜， 遺傳作圖（genetic mapping）又稱連鎖圖譜（linkage map），是通過測定重組率，確定用重組率表示的基因之間的相對位置。物理圖譜（physical map）是利用各種分子標(biāo)記確定片段間的連接順序，以及遺傳標(biāo)志之間用千堿基（kb）或兆堿基（Mb）表示的物理距離。重疊群的建立， 染色體被分解并完成測序后，需要組裝，低分辨率物理圖譜可以為組裝提供標(biāo)記。制作低分辨率物理圖譜，廣泛使用序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequence tagged site, STS）。所謂的

5、STS是在染色體上定位明確，且可用PCR擴(kuò)增的單拷貝序列。高分別率物理圖譜的制作，重疊群克隆中的大片段通常要被分解成較小的片段，用BAC進(jìn)行亞克隆后，才可被用來通過隨機(jī)切割進(jìn)行測序。由于亞克隆中的片段也需要組裝，在分解大片段之前，需要制作大片段的高分辨率物理圖譜。制作高分辨率物理圖譜，可以采用多種不同的分子標(biāo)記。（1）限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記 （2）DNA重復(fù)序列的多態(tài)性標(biāo)記 （3）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記 序列測定 在制作高分別率物理圖譜的基礎(chǔ)上，就可以對BAC中插入的片段逐個進(jìn)行測序?；蚨ㄎ?基因定位的一個基本方法是重組分析，若某致病基因和某個分子標(biāo)記如微衛(wèi)星DNA的重組率超過5%，說明二者不

6、連鎖，若重組率接近于零，說明該基因位于標(biāo)記位點(diǎn)符近。 基因定位的另一個基本方法，是根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，設(shè)計特異性的探針，通過分子雜交，篩選cDNA文庫，這種方法稱作功能克隆。概述用分光光度法進(jìn)行定量測定的常用方法和為減小測量誤差應(yīng)注意的問題1. 吸光系數(shù)法（絕對法） 根據(jù)比爾定律A = c l ，若 l 和吸光系數(shù)或E1%1cm已知，即可根據(jù)測得的A，求出被測物的濃度。 C = A / l 通常和E1%1cm可以在手冊或文獻(xiàn)中查到2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 （1）配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 （2）在測定條件相同的情況下，分別測定其吸光度。 （3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（不必考慮顯色劑等引起的

7、體積和濃度變化），以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。 （4）在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。3. 對照法 在同樣條件下配置標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在選定波長處，分別測量吸光度，根據(jù)定律 A標(biāo)=EC標(biāo)l A樣=EC樣l 在同種物質(zhì)、同臺儀器及同一波長測定的條件下l 和E 均為定值，所以： 減小測定誤差的方法1. 選擇合適的顯色劑，使顯色反應(yīng)的靈敏度高、選擇性好、顯色產(chǎn)物穩(wěn)定。 2. 通過條件試驗，找出最佳的試劑加入量、酸度、溫度和顯色時間。并使樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在盡可能完全相同的條件下進(jìn)行測定。 3. 設(shè)置合適的對照。 4. 通過加掩蔽劑和控制pH值，消除共存離子的干擾。

8、5. 盡可能在吸光度0.11.0范圍內(nèi)測定，以減小吸光度誤差。A < 0.1的溶液，盡量用摩爾吸光系數(shù)大的顯色反應(yīng)，在最大吸收波長處進(jìn)行測定，吸收池厚度大一些，溶液可通過萃取、濃縮、增大取樣量來增加吸光度。A > 1.0的溶液，可通過稀釋或用薄的吸收池來降低吸光度。 6. 減小儀器誤差。用穩(wěn)壓器穩(wěn)定電壓以使入射光強(qiáng)度保持不變；吸收池厚度應(yīng)一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池與入射光線應(yīng)垂直，否則會因光程增大而發(fā)生誤差。 比較用定時法，連續(xù)檢測法和平衡法測定酶活力的優(yōu)缺點(diǎn) 1 測定酶反應(yīng)開始后某一時間內(nèi)（t1到t2）產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來求取酶反應(yīng)初速度 的方法稱為定時法 這

9、種方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單，因最后測定產(chǎn)物時酶反應(yīng)已被終止，故比色池?zé)o需保溫裝置，顯色劑的選擇也可不考慮對酶活力的影響。缺點(diǎn)是如果不用預(yù)試驗確定，無法了 解酶作用的這段時間內(nèi)是否都是零級反應(yīng)，故很難保證測定結(jié)果的真實(shí)性。 2 連續(xù)測定（每15s1min監(jiān)測一次）酶反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時間的變化來求出酶反應(yīng)初速度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測法這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可將多點(diǎn)的測定結(jié)果（s或p的變化）連接成線，容易找到成直線的區(qū)段，可以觀察到是否偏離零級反應(yīng)，因而可選擇線性反應(yīng)期來計算酶活力，不需要終止反應(yīng)。缺點(diǎn)是因酶和底物邊保溫邊測定的需要，儀器（比色計或分光光度計）必須有保溫裝置，而且產(chǎn)物（或底物）應(yīng)是

10、可被直接測定的化合物，且借以測定的特殊性質(zhì)，必須與底物（或產(chǎn)物）有明顯差別，否則，需加入其它試劑（如顯色劑、酶試劑等），將其轉(zhuǎn)變成可測物質(zhì)，但必須專慮到加入的酶試劑或顯色劑對待測酶是否有影響。3通過測定酶反應(yīng)開始至反應(yīng)達(dá)到平衡時產(chǎn)物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法稱為平衡法。用平衡法測定時，因產(chǎn)物的增加或底物的減少與反應(yīng)時間不成線性，故不能把p或s 的總變化量除以t來代表每分鐘產(chǎn)物或底物的變化。另外，平衡法也會受到產(chǎn)物抑制、可逆 反應(yīng)等因素的影響，由于反應(yīng)時間較定時法更長，故這種影響會更大，測定結(jié)果也較連續(xù)監(jiān) 測法低，不能代表初速度，也不是零級反應(yīng)的速度。但是與定時法相同，只要待測標(biāo)本與正

11、常標(biāo)本在相同條件下反應(yīng)并測定，亦能以此判斷出待測標(biāo)本酶活力的相對大小。而且，對于有些零級反應(yīng)期很短的酶促反應(yīng)，用連續(xù)監(jiān)測法和定時法很難測出其初速度，也只得采用平衡法測定。 抽提蛋白質(zhì)時，哪些因子可影響抽提的效率（1）pH值改變?nèi)苜|(zhì)解離狀態(tài)。 對蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，一般選擇抽提液的pH值應(yīng)在偏離等電點(diǎn)的穩(wěn)定范圍內(nèi)。通常堿性蛋白質(zhì)選用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白質(zhì)選用高pH值的溶液抽提，或者用調(diào)至一定pH值的有機(jī)溶劑抽提。 （2）溶劑的極性和離子強(qiáng)度 有些生物大分子在極性大、離子強(qiáng)度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強(qiáng)度低的溶液中穩(wěn)定。一種物質(zhì)溶解度大小與溶劑性質(zhì)密切相關(guān)（相

12、似相溶原理）；離子強(qiáng)度通過影響溶質(zhì)的帶電性也影響溶質(zhì)的溶解度。一般離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液可促進(jìn)蛋白溶解（鹽溶），高離子強(qiáng)度的中性鹽可引起蛋白質(zhì)沉淀，析出（鹽析）。高離子強(qiáng)度使DNA溶解度增加；低離子強(qiáng)度使RNA溶解度增加（核酸分離依據(jù)）。（3）水解酶 細(xì)胞破裂后，許多水解酶釋放出來。水解酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實(shí)驗失敗。為此，必須采用加入抑制劑，調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子濃度或極性等方法，使這些酶喪失活性（4）溫度 提高溫度，溶解度增加，但易使大分子物質(zhì)變性失活。小分子物質(zhì)：5070；生物大分子：010，最好控制在04（5）攪拌 攪拌能促使欲抽提物與抽提液的接

13、觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法 ，速度太快時容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類變性失活。（6）氧化 一般蛋白質(zhì)都含相當(dāng)數(shù)量的巰基，該基團(tuán)常常是酶和蛋白質(zhì)的必須基團(tuán)，若抽提液中存在氧化劑或氧分子時，會使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶（或蛋白質(zhì)）失活（或變性）。在提取液中加入巰基乙醇，半胱氨酸。還原性谷胱甘肽等還原劑，可防止巰基發(fā)生氧化，使蛋白，酶失活。（7）金屬離子 蛋白質(zhì)的巰基除易受氧化劑作用外，還能和金屬離子如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。 （8）抽提液與抽提物的比例 在抽提時，抽提液與抽提物的比例要適當(dāng)，一般以51為宜。概述對提取物進(jìn)行濃縮的常用方法1. 鹽析法 用添

14、加中性鹽的方法來使某些蛋白質(zhì)（或酶）從稀溶液中沉淀出來，從而達(dá)到樣品濃縮的目的。最常用的中性鹽是硫酸銨，其次是硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸鉀等。2. 有機(jī)溶劑沉淀法 在生物大分子的水溶液中，逐漸加入乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，可以使生物大分子物質(zhì)的溶解度明顯降低，從溶液中沉淀出來，這也是濃縮生物樣品的常用方法。其優(yōu)點(diǎn)是溶劑易于回收，樣品不必透析除鹽。在低溫條件下用有機(jī)溶劑沉淀法得到的多種生物大分子可保持生物活性，但某些蛋白質(zhì)或酶易變性失活，應(yīng)小心操作。3. 葡聚糖凝膠濃縮法 向稀樣品溶液中加入干的葡聚糖凝膠（Sephadex）G-25，緩慢攪拌30 min，葡聚糖凝膠吸水膨脹，進(jìn)行吸濾，生物大分子全

15、部留在溶液中，如此重復(fù)數(shù)次，可在短時間使溶液濃縮，每次葡聚糖凝膠的加入量為溶液量的1/5為宜，用過的葡聚糖凝膠經(jīng)去離子水洗凈后，用乙醇脫水干燥后可重復(fù)使用。4. 聚乙二醇濃縮法 將待濃縮液裝放入透析袋內(nèi)，袋外復(fù)蓋聚乙二醇，袋內(nèi)的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在極短時間內(nèi)，可以濃縮幾十倍至上百倍。被溶劑飽和的聚乙二醇經(jīng)加熱除去溶劑后可再次使用。5. 超濾濃縮法 適用于生物大分子的濃縮或脫鹽，并具有不存在相變、不添加任何化學(xué)物質(zhì)、成本低、操作方便、條件溫和、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。通過超濾法，蛋白質(zhì)和酶的稀溶液一般可濃縮到1050濃度，回收率高達(dá)90。應(yīng)用超濾法的關(guān)鍵是根據(jù)實(shí)驗需要選擇合適的濾膜和超濾裝

16、置。 膜板式超濾裝置，截留面積有限。中空纖維超濾在一支空心柱內(nèi)裝著許多的中空纖維毛細(xì)管，管的內(nèi)徑一般在0.2 mm左右，極大地增加了滲透的表面積，提高了超濾的速度。通過蠕動泵或液壓泵將待超濾液注入中空纖維管內(nèi)，小分子和溶劑被擠出管外，大分子逐步被濃縮，同時可以去除小分子和鹽分。6. 常壓蒸發(fā)法 蒸發(fā)是溶液表面的水或溶劑分子獲得的動能超過溶液內(nèi)分子間的吸引力以后，脫離液面進(jìn)入空間的過程。在常壓下加熱使溶劑蒸發(fā)，溶液被濃縮稱常壓蒸發(fā)。該法操作簡單，但僅適于濃縮耐熱物質(zhì)。7. 真空減壓濃縮法 此法適于濃縮遇熱易變性的物質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子。當(dāng)盛液的容器與真空泵相連而減壓時，溶液表面

17、的蒸發(fā)速率將隨真空度的增高而增大。簡述差速離心，密度梯度離心和等密度離心的特點(diǎn)1. 差速離心法 這是最普通的離心法。即采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。此法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。差速離心首先要選擇好顆粒沉降所需的離心力和離心時間。當(dāng)以一定的離心力在一定的離心時間內(nèi)進(jìn)行離心時，在離心管底部就會得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大較重顆粒的沉淀及含較小和較輕顆粒的上清液，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好地分離開。此法所得的沉淀是不均一的，仍雜有其它

18、成分，需經(jīng)過23次的再懸浮和再離心，才能得到較純的顆粒。2. 密度梯度離心 又稱速率區(qū)帶離心法。是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。此法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒（20% 的沉降系數(shù)差或更大）或分子質(zhì)量相差3倍的蛋白質(zhì)。大小相同，密度不同的顆粒（如線粒體，溶酶體等）不能用此法分離。3. 等密度離心 密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在預(yù)先制備好的梯度介質(zhì)溶液頂上，或先與梯度液混合后

19、裝入離心管，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。 離心時，樣品的低密度的顆粒向上浮起，高密度的顆粒向下沉降，一直移動到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，形成不同的區(qū)帶。凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的實(shí)驗原理當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。 按照分離機(jī)制可將HPLC分為哪幾種主

20、要類型1. 液固吸附色譜 以吸附劑為固定相，以不同極性的溶劑為流動相，根據(jù)試樣中各組分吸附能力的不同而進(jìn)行分離的方法，稱液相吸附色譜。在HPLC中常用全多孔型硅膠微粒為吸附劑。2. 液-液分配色譜 按照固定相和流動相極性的差別，可分為正相與反相色譜法兩類。 正相液液色譜法 流動相極性小于固定相的液-液色譜法稱正相液-液色譜法。 反相液-液色譜法 流動相極性大于固定相的液-液色譜法稱反相液-液色譜法3. 離子交換色譜 由于聚苯乙烯樹脂類具膨脹性，不耐壓，HPLC的離子交換劑多用薄殼型或全多孔微粒硅膠為載體，表面化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，常用的為強(qiáng)酸性磺酸基和強(qiáng)堿型季銨鹽。4. 空間排斥（凝膠）色

21、譜 由苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)而成的半硬質(zhì)凝膠柱效較高，常用有機(jī)溶劑為流動相，缺點(diǎn)是具膨脹性，流動相流經(jīng)時柱的填充狀態(tài)會發(fā)生變化。以多孔硅膠及多孔玻璃珠等無機(jī)材料制成的硬質(zhì)凝膠，在溶劑中不變形，但裝柱時易碎，柱效較差，吸附性較強(qiáng)，有時易拖尾。 5. 親和色譜 常用的基質(zhì)有高度交聯(lián)的Sephadex和Bio-gel等瓊脂糖凝膠，大孔徑聚丙烯酰胺凝膠和多孔硅膠，配基選擇及交換劑合成的原理類似經(jīng)典親和層析。簡要說明HPLC的儀器構(gòu)成和主要的應(yīng)用領(lǐng)域高效液相色譜儀通常由溶劑輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)和檢測記錄系統(tǒng)四部分組成。1. 高壓泵：由于HPLC的固定相顆粒很小，柱阻力很大，故載液必須用高壓泵來

22、輸送，通常柱前壓達(dá)1530MPa，才能獲得高速的液流，以達(dá)到快速分離目的。2. 進(jìn)樣裝置：為了將試樣有效地送入色譜柱，可用微量注射器通過六通進(jìn)樣閥的進(jìn)樣口注入樣液；亦可將樣液先注入與柱頭相連的貯樣環(huán)管，然后利用切換閥讓載液將樣品定量地送入色譜柱。 3. 色譜柱 固定相可通過干法或濕法在高壓下裝入色譜柱，要求填充均勻。多數(shù)使用者可直接購置各種類型的預(yù)裝柱，在使用過程中由于雜質(zhì)污染往往使柱效逐漸降低，因此，每次測定后要用流動相慢速（0.1mL/min）沖洗柱子，使其再生。4. 檢測器：目前應(yīng)用較多的是紫外檢測器、差示折光檢測器和熒光檢測器。紫外檢測器是基于試樣中的待測組分對特定波長的紫外光有選擇性

23、的吸收，其吸光度與組分消光度成正比的關(guān)系進(jìn)行檢測的差示折光檢測器是利用連續(xù)測定流通池中溶液折射率的變化來測定試液濃度的檢測器。熒光檢測器是根據(jù)某些物質(zhì)在紫外光照射下具有熒光的特性來檢測的。已成為化學(xué)，醫(yī)學(xué)，工業(yè)，農(nóng)學(xué)，商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。說明SDS-PAGE 和 IEF/SDS-PAGE 的原理和主要用途SDS-PAGE 由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用Mr差異將各種蛋白質(zhì)分開。它不僅用于蛋白質(zhì)Mr測定，還可用于蛋白混合組分

24、的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來，除去SDS，還可進(jìn)行氨基酸順序、酶解圖譜及抗原性質(zhì)等方面的研究。IEF/SDS-PAGE 雙向PAGE電泳是由兩種類型的PAGE組合而成。樣品經(jīng)第一向電泳分離后，再以垂直它的方向進(jìn)行第二向電泳。如這二向電泳體系pH及凝膠濃度完全相同，則電泳后樣品中不同組分的斑點(diǎn)基本上呈對角線分布，對提高分辨率作用不大。第一向為IEF-PAGE，第二向為SDS-PAGE，簡稱為IEF/SDS-PAGE；基本原理與IEF-PAGE，SDS-PAGE完全相同。 IEF/SDS-PAGE雙向電泳已成為當(dāng)前分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的實(shí)

25、驗技術(shù)，可廣泛用于生物大分子如蛋白質(zhì)，核酸酶解片段及核糖體蛋白質(zhì)的分離和精細(xì)分析，是蛋白質(zhì)組學(xué)的基本方法概述巢式PCR，反向PCR，錨定PCR，實(shí)時定量PCR的特點(diǎn)和主要應(yīng)用1. 巢式PCR（nested PCR） 先用一對引物對模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用另一對引物擴(kuò)增第一對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，這一PCR 技術(shù)即巢式PCR。第一次擴(kuò)增所用引物稱外引物（outer-primer），第二次擴(kuò)增作用的引物稱內(nèi)引物（inter-primer）。一般應(yīng)用于動物方面，如病毒，HIV，腫瘤基因等。2反向PCR（inverse PCR） 擴(kuò)增引物相反方向DNA序列的PCR技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR中，要先將含有一

26、段已知序列的感興趣的未知DNA片段進(jìn)行酶切和環(huán)化，然后直接進(jìn)行PCR，也可將已知序列酶切環(huán)化后再進(jìn)行PCR。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴(kuò)增。3錨定PCR（anchored PCR）用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA 3'端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對該cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建4實(shí)時定量PCR實(shí)時定量PCR（real time PCR）在每個反應(yīng)管中加入熒光標(biāo)記物，擴(kuò)增產(chǎn)物越多，熒光強(qiáng)度越大。在進(jìn)行RT-PCR的過程中，實(shí)時檢測各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度，做出每個樣本熒光強(qiáng)度隨擴(kuò)增次數(shù)變化的曲線

27、。應(yīng)用： mRNA表達(dá)的研究，DNA拷貝數(shù)的檢測，單核苷酸多態(tài)性的測定比較設(shè)計PCR引物和寡核苷酸探針應(yīng)遵循的基本原則，并指出設(shè)計不當(dāng)會造成什么后果引物設(shè)計一般遵循以下原則：(1) 引物長度 一般為1530b，引物太短，就可能同非靶序列雜交得到不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物。 (2) G + C含量 G + C含量一般為40%60%。引物的G+C含量和引物Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)，按公式 Tm = 4(G + C) + 2(A + T) 估計引物的Tm值。(3) 堿基的隨機(jī)分布 引物中4種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，不要多個嘌呤或多個嘧啶連續(xù)出現(xiàn)。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，以免自身折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響與模板的退火結(jié)合。兩引物之間也

28、不應(yīng)有互補(bǔ)性，尤其是避免3端的互補(bǔ)而形成引物二聚體，使靶序列的擴(kuò)增量下降。(4) 引物濃度 引物的濃度一般為0.10.5mol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。 設(shè)計寡核苷酸序列用于分子雜交時應(yīng)遵循以下幾個原則： （1）探針長度 一般要求1050bp。過短則特異性降低，過長則不僅合成較困難，而且延長雜交時間。 （2）GC對含量 應(yīng)為40%60%，超出此范圍會增加非特異性雜交。（3）一定不要含有探針內(nèi)部互補(bǔ)順序 即不應(yīng)有4bp的堿基反向互補(bǔ)配對，否則會形成探針內(nèi)部“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。（4）避免有同一堿基的連續(xù)出現(xiàn) 不可4個，如-GGGGG-。（5）最好用計算機(jī)與已知的各種基因序列進(jìn)行同

29、源性比較 如果此寡核苷酸序列與非靶基因序列有70%以上的同源性或連續(xù)8個以上的堿基序列相同，則最好不用，重新設(shè)計。進(jìn)行基因克隆時，可以通過哪些途徑獲取目的基因，并簡要評價這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)1. 基因組DNA的非特異性斷裂 超聲波處理基因組DNA可得到300bp左右的隨機(jī)片段，高速組織搗碎器，控制一定的條件也能得到不同大小的DNA片段，如將高分子量DNA 1500r/m搗碎30分鐘，可得到大約8kb的DNA片段。由機(jī)械處理產(chǎn)生的DNA片段末端不一，斷點(diǎn)隨機(jī)，條件難以掌握，所以目前較少使用這種方法。2. 染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解 型限制性內(nèi)切酶可專一識別并切割特定的DNA順序，產(chǎn)生不同類型的D

30、NA末端。若載體DNA與插入片段用同一種內(nèi)切酶消化，可以直接進(jìn)行連接。3. 通過mRNA合成cDNA 基因組DNA中重復(fù)順序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比較困難。用mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到相應(yīng)的雙鏈cDNA，再進(jìn)行克隆，獲得較完整的連續(xù)編碼順序，容易在宿主細(xì)胞中表達(dá)。4. 人工體外合成DNA片段一些小分子生物活性多肽，可以通過人工合成編碼順序插入載體后，轉(zhuǎn)化細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)。分子較大的基因，可以通過分段合成，然后連接組裝成完整的基因。目前已經(jīng)合成了人胰島素A、B鏈基因和干擾素基因，并成功表達(dá)，制備成商業(yè)產(chǎn)品。5. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增特定基因片段 對于有部分了解或完全清楚的基因

31、，可以通過PCR反應(yīng)，直接從染色體DNA或cDNA上高效快速地擴(kuò)增出目的基因片段，然后進(jìn)行克隆操作。唯一的要求是，對基因片段兩側(cè)的序列了解清楚。 6. 用cDNA文庫選擇特定的基因（1）用斑點(diǎn)雜交選擇特定的克隆 （2）用已知的氨基酸序列選擇特定的克?。?）差別雜交 （4）扣除雜交進(jìn)行基因克隆時，篩選重組子常用哪些方法（一）針對遺傳表型改變的篩選法1. 插入失活雙抗生素對照篩選 如前述pBR322質(zhì)粒，若外源DNA插入tetr基因，則先將轉(zhuǎn)化菌接種到含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上，凡生長的菌落均含有質(zhì)粒。再用無菌牙簽將這些菌落接種到含四環(huán)素平板培養(yǎng)基 的對應(yīng)位置，凡不能生長者均含有重組質(zhì)粒，擴(kuò)大培養(yǎng)

32、這些菌落，即可擴(kuò)增重組質(zhì)粒。 2. 插入表達(dá)篩選 有些載體設(shè)計時，在篩選標(biāo)志基因前面連接一段負(fù)控制序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)3.-半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選 通過插入失活lacZ基因的載體包括M13噬菌體，pUC質(zhì)粒系列，pEGM質(zhì)粒系列等。它們的共同點(diǎn)是載體上攜帶一段細(xì)菌的基因lacZ，它編碼-半乳糖苷酶的一段146個氨基酸的-肽 ，重組子中基因插入使-肽基因失活不能形成-互補(bǔ)作用，在X-gal平板上，含陽性重組體的細(xì)菌為無色噬菌斑或菌落，載體自身環(huán)化后轉(zhuǎn)化的細(xì)菌為蘭色噬菌斑或菌落（二）分析重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選法1. 快速裂解菌落鑒定分子大小 從平板中直接挑取菌落裂

33、解后，不需要內(nèi)切酶消化，直接進(jìn)行凝膠電泳，與載體DNA比較遷移率，初步判斷是否有插入片段存在，本方法適用于插入片段較大的重組子初步篩選。2. 內(nèi)切酶圖譜鑒定對于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應(yīng)小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA ，用相應(yīng)的內(nèi)切酶（1種或2種）切割重組子釋放出插入片段，對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測插入片段和載體的大小3. Southern印跡雜交為了進(jìn)一步確定DNA插入片段的正確性，在內(nèi)切酶消化重組子，凝膠電泳分離后，通過Southern印跡轉(zhuǎn)移將DNA移至硝酸纖維膜上，再用放射性核素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA片段作

34、為探針，進(jìn)行分子雜交，鑒定重組子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。 4. PCR篩選重組子 一些載體的外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)，存在恒定的序列，用相應(yīng)的引物對小量抽提的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR分析，不但可迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行DNA順序分析。5. 菌落（或噬菌斑）原位雜交 菌落或噬菌斑原位雜交技術(shù)是先將轉(zhuǎn)化菌直接鋪在硝酸纖維素薄膜或瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)移到另一硝酸纖維素薄膜上，用核素標(biāo)記的特異DNA或RNA探針進(jìn)行分子雜交，然后挑選陽性克隆菌落。用原核生物表達(dá)真核基因時，引用哪些措施提高表達(dá)水平？（一）提高翻譯水平1. 調(diào)整SD序列與ATG之間的距離 SD順序與ATG的距離不同，IL-2表

35、達(dá)水平可相差22000倍。2. 用點(diǎn)突變的方法改變某些堿基 緊隨起始密碼下游的幾組密碼子不同，可使基因的表達(dá)效率相差1520倍。 另外，在不改變編碼的氨基酸順序的條件下，盡量用強(qiáng)密碼子取代弱密碼子，確有可能提高表達(dá)水平。3. 增加mRNA的穩(wěn)定性 多數(shù)情況下，細(xì)菌mRNA的半哀期短，僅為12分鐘，而外源基因mRNA的半衰期可能更短。若能增加mRNA的穩(wěn)定性，則有可能提高外源基因的表達(dá)水平。（二）減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷1. 表達(dá)載體的誘導(dǎo)復(fù)制 減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷的一個重要措施，是當(dāng)宿主菌生物量積累到一定水平后，再誘導(dǎo)細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的復(fù)制。2. 誘導(dǎo)表達(dá)將宿主菌的生長和外源基因的表達(dá)分開成為兩個階段，是減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷最常用的方法（三）提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性 在大腸桿菌中表達(dá)的外源蛋白往往不夠穩(wěn)定，常被細(xì)菌的蛋白酶降解，因而會使外源基因的表達(dá)水平大大降低。因此，提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止細(xì)菌蛋白酶的降解是提高外源基因表達(dá)水平的有力措施1. 表達(dá)融合蛋白 2. 采用某種突變菌株保護(hù)表達(dá)蛋白 大腸桿菌蛋白酶