電針治療對大鼠脊髓損傷后Nogo_A蛋白表達的影響

1、.DOC格式論文，方便您的復制修改刪減電針治療對大鼠脊髓損傷后Nogo_A蛋白表達的影響（作者:_單位: _郵編: _） 作者：李振鵬，孔抗美，陳育春，郭天明，陳澤鋒，劉加貝 【摘要】 目的：探討電針治療對大鼠脊髓損傷(SCI后Nogo_A蛋白表達的影響。方法：以96只2月齡Wistar大鼠為受試對象，SCI組于T9處行脊髓全橫斷，治療組予電針治療，采用Western blot測定各時間點及各組脊髓Nogo_A表達及變化,并以蘇木精_伊紅和免疫組化染色對受損脊髓進行形態(tài)學觀察。結(jié)果：SCI后Nogo_A蛋白表達呈遞增趨勢，于14d后最強；經(jīng)電針治療，Nogo_A表達減少。結(jié)論：Nogo_A是S

2、CI后脊髓神經(jīng)纖維再生的主要抑制因子，電針治療對Nogo_A表達具有明顯的抑制作用。 【關(guān)鍵詞】 電針；脊髓損傷；Nogo_A蛋白AbstractObjective: To study the effect of electroacupuncture on the expression of Nogo_A protein in rats with spinal cord injury(SCI. Methods: Ninety_six adult Wistar rats were randomly assigned into control group(A, SCI group(B, sham_

3、treatment group(Cand electroacupuncture treatment group(D. Group B, C and D were received transect SCI at the T9 vertebrae level while group A was just opened the vertebra and their spinal cords were not wounded. Group D was treated with electroacupuncture. All the spinal cords of the trauma section

4、 were taken out at different time points after o_peration. Western blot and immunohistochemical methods were used to examine the change of the expression of Nogo_A in these tissue. Results： Just minim Nogo_A was found in the control group, while the manifold expression of Nogo_A was found after oper

5、ation，especially at the end of the second week, the expression was inhibited by electroacupuncture. Conclusion: Nogo_A is a major suppressor factor of spinal cord nerve fiber regeneration after SCI, and the electroacupuncture can obviously inhibit the expression of Nogo_A protein.Key Wordselectroacu

6、puncture，spinal cord injury，Nogo_A protein脊髓損傷(SCI臨床常見，致癱率較高。電針是治療SCI的重要方法,其療效已獲得臨床實踐和動物實驗1_2的證實，但其作用機制尚未完全明確。本實驗通過電針治療SCI大鼠，于不同時間點采集大鼠受傷脊髓段，以Western blot測定其Nogo_A蛋白表達，探討電針治療SCI的機制。1 材料與方法1.1 動物模型制作Wistar大鼠(廣東省實驗動物中心提供96只(2月齡，體質(zhì)量220270，雌雄各半，隨機分為對照組(A組。24只和SCI組(72只。SCI組于T9處行脊髓全橫斷，然后再隨機分為損傷組(B組，硬膜外腔不留

7、置電極、治療對照組(C組，留置電極但不通電和電流刺激治療組(D組，損傷部位上下端的椎間隙硬膜外腔留置電極，予G6805_2型多用治療儀治療，強度以大鼠有輕微肌肉抽動和無明顯不安嘶叫為適，每天治療30min，療程至處死動物取標本前為止，各組24只。各組分別于術(shù)后1、7、14和28d取各損傷部位的脊髓組織(每組3只置_70冰箱保存?zhèn)溆谩?.2 Western blot測定Nogo_A蛋白取各組脊髓樣本40mg，加入細胞裂解液30L，冰浴下研磨勻漿，煮沸后7500r/min離心取上清液，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，提取總蛋白，電泳，結(jié)束后按常規(guī)轉(zhuǎn)膜。在膜封閉液內(nèi)封閉，4保存6h，加

8、一抗，與封閉液混勻后4冰箱過夜。TBS液清洗3次，加入封閉液后滴加二抗(1400稀釋，室溫振蕩混勻1h，TBS清洗膜3次，加化學發(fā)光劑，在暗室條件下顯影和定影制成X光片。將各組X光片掃描后采用C_IMAGING SYSTEMS軟件進行灰度分析，以Nogo_A蛋白和內(nèi)標蛋白(actin灰度的比值作為Nogo_A蛋白的相對表達量。1.3 病理標本制備術(shù)后1、7、14和28d時,隨機取大鼠每組3只，質(zhì)量濃度20g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg腹腔注射麻醉后開胸，自左心室插管至主動脈，剪開右心耳，先灌注PBS 150mL，再灌注質(zhì)量濃度40g/L多聚甲醛250mL，固定。2后取出以傷段為中心的長約20

9、mm(810脊髓組織，放入相同固定液繼續(xù)固定，24后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚約4m，分別進行蘇木精_伊紅及Nogo_A抗體免疫組化染色，觀察受損節(jié)段組織學改變。1.4 免疫組化染色免疫組化染色采用ABC法，切片脫蠟至水，微波修復抗原，滴加封閉液，及抗Nogo_A工作液，室溫37 1d，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精輕度對比染色，脫水、封固。實驗中設立嚴格的正常血清對照和陰性對照。1.5 統(tǒng)計學處理結(jié)果以±s表示，分別比較A、B、C組各時間點Nogo_A表達，采用t檢驗，0.05，SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析。第3期 李振鵬等.電針治療對大鼠脊髓損傷后Nogo_A蛋白表達的影響2 結(jié)

10、果2.1 蘇木精_伊紅染色光鏡下見B、C組脊髓組織有較多片狀出血及出血壞死后形成的囊腔,組織疏松水腫,神經(jīng)細胞變性,部分神經(jīng)纖維溶解消失,炎癥細胞浸潤明顯。D組脊髓組織點灶狀出血、壞死,范圍局限,組織輕度水腫。A組脊髓組織未見出血、壞死及組織水腫、變性等。2.2 Western blot檢測結(jié)果Western blot結(jié)果顯示各組脊髓均有Nogo_A蛋白表達。B、C組Nogo_A蛋白表達呈遞增趨勢，損傷14d后表達最強，以后逐漸降低(圖1，封2。B、C組表達明顯高于A、D組(圖2，封2。2.3 Nogo_A免疫組化染色結(jié)果陽性判斷標準：陽性信號位于胞漿,呈棕黃色，胞核不著色。A組有少量Nogo

11、_A免疫陽性細胞，免疫陽性反應產(chǎn)物主要分布于胞質(zhì)和突起中(圖3，封2。B、C組脊髓橫斷區(qū)域灰質(zhì)和白質(zhì)Nogo_A表達與正常對照的脊髓相同，但染色呈強陽性(圖4，封2。陽性表達在傷后7d開始升高，以傷后14d時最為顯著,傷后28d一直維持較高的表達水平，表達較正常組顯著升高。D組脊髓組織中有散在分布的陽性細胞,細胞近似圓形，部分細胞可見突起(圖5，封2，陽性表達在治療后7d開始較B、C組降低，治療后28d一直維持在較低水平。各組不同時間點陽性細胞平均灰度值見表1。表1 大鼠脊髓Nogo_A陽性細胞平均灰度值3 討論近年來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS纖維再生的認識已發(fā)生了改變3_4。認為成年CNS神經(jīng)元

12、再生能力弱，其原因是CNS的微環(huán)境不利于神經(jīng)再生,存在著抑制軸突再生的分子。在眾多不利因素中，尤以Nogo最為突出5。Nogo是重要的神經(jīng)突起生長抑制因子，對神經(jīng)突起的生長具有很強的抑制作用，它有3種主要異構(gòu)體(Nogo_A,Nogo_B和Nogo_C，其中Nogo_A與神經(jīng)再生的關(guān)系最為密切5_6，不但具有和Nogo受體作用的Nogo_66序列，而且具有額外的獨特抑制區(qū)域，離體和活體實驗均已證實它與動物CNS神經(jīng)軸索的再生關(guān)系密切。Nogo_A對神經(jīng)元軸索的外生也具有極強的抑制作用,鞘內(nèi)注入單克隆抗體IN_1或Nogo_66受體拮抗肽NEP1_40能顯著促進SCI大鼠皮質(zhì)脊髓束纖維的再生及感

13、覺和運動功能的改善7。Nogo_A廣泛表達于CNS中，分布特點與CNS再生能力低下的特征相符合。所有這些都表明Nogo_A在哺乳動物CNS神經(jīng)纖維的再生修復中起重要作用。SCI后，神經(jīng)細胞能否再生修復，如何最大限度恢復脊髓功能，減少或預防繼發(fā)性損傷，以及SCI恢復機理，一直是基礎(chǔ)研究的熱點，也是國際脊髓信托基金會制定的SCI研究方向。自1920年發(fā)現(xiàn)電場能夠促進神經(jīng)生長至今，已有大量的動物實驗和臨床試驗發(fā)現(xiàn)電針能促進SCI后神經(jīng)功能的恢復810。本實驗組前期工作1_2也發(fā)現(xiàn)電針治療能調(diào)控損傷脊髓組織中凋亡基因的表達，是治療SCI的重要方法。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常脊髓組織可見少量Nogo_A表達，

14、說明Nogo_A的作用不一定完全與神經(jīng)突起的生長有關(guān)，或者正常脊髓組織處在一個復雜的平衡環(huán)境中；SCI后Nogo_A表達逐步上升，在神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕周圍的脊髓組織中呈強陽性表達,但在瘢痕中幾乎無表達,在損傷后14d表達最強，隨后下降，但仍保持在較高水平，說明SCI后14d內(nèi)為修復損傷的一個時間窗口，提示越早治療效果越好。SCI后，影響CNS神經(jīng)纖維再生的因素是多方面的，Nogo_A并不是惟一因素。采用電針刺激治療，電流直接跨越脊髓橫斷處病灶，刺激上下行神經(jīng)纖維,使上位神經(jīng)元與下位神經(jīng)元形成假性信息溝通,反饋刺激了大量神經(jīng)細胞及上下行神經(jīng)纖維的生長,Nogo_A表達也被抑制，從而促進神經(jīng)元功能的恢復

15、，可能有助SCI的修復。但是，電針刺激通過什么樣的信息傳導通路對Nogo_A表達進行調(diào)控，以及是否還有其它調(diào)控因素和適宜的電針刺激參數(shù)，還未清楚?！緟⒖嘉墨I】1李振鵬, 孔抗美, 齊偉力. 針刺對大鼠慢性脊髓損傷后Bax和Bcl_2表達的影響J. 昆明醫(yī)學院學報, 2004, (1: 45-48. 2李振鵬, 孔抗美, 鄭欽洪, 林曉琪, 齊偉力. 針刺治療大鼠慢性脊髓損傷的療效觀察和機理研究J. 海南醫(yī)學, 2007, 18(8： 129-130. 3CHONG M S, WOOLF C J, TURMAINE M, et al. Intrinsic versus extrinsic fac

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