電化學(xué)酶?jìng)鞲衅髦谱骷夹g(shù)及應(yīng)用

1、電化學(xué)酶?jìng)鞲衅髦谱骷夹g(shù)及應(yīng)用一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ㄒ唬?掌握電化學(xué)工作站的原理和操作（二） 學(xué)習(xí)酶電極構(gòu)建方法（三） 學(xué)習(xí)各類電化學(xué)檢測(cè)方法和技術(shù)，并探討它們?cè)趯?shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。二、 實(shí)驗(yàn)試劑半胱氨（20mM）、戊二醛(wt2.5%)、辣根過氧化物酶（HRP，20mg/ml），PBS緩沖液（ PH=7.4），水溶液（1 mM），對(duì)苯二酚（1 mM）,所配溶液均用二次蒸餾水。三、 實(shí)驗(yàn)儀器 上海辰華儀器公司CHI 760B電化學(xué)工作站，其中金電極為工作電極，鉑電極為輔助電極，甘汞電極為參比電極四、 實(shí)驗(yàn)原理電化學(xué)酶生物傳感器工作示意圖如下所示：電化學(xué)酶生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)單元由生物敏感分子(固定

2、化酶膜)和信號(hào)轉(zhuǎn)換器(基礎(chǔ)電極)組成。在本實(shí)驗(yàn)中，過氧化氫氧化酶膜可以選擇性識(shí)別被檢測(cè)物質(zhì)，發(fā)生酶促反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)信號(hào)，基礎(chǔ)電極將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。下面，我們具體闡述一下酶電極的構(gòu)建和電化學(xué)工作站工作的原理：（1）電化學(xué)生物傳感界面（酶電極）的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)采用交聯(lián)法制備酶電極，利用戊二醛雙功能官能團(tuán)試劑，使生物分子彼此共價(jià)結(jié)合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。首先，半胱胺巰基鍵與金電極形成金硫鍵，然后半胱胺上的醛基氨基與戊二醛的醛基縮合，最后，利用HRP上的氨基與戊二醛縮合，制備完整的電化學(xué)酶?jìng)鞲薪缑?。制備好的酶電極示意圖如下所示： （2）電化學(xué)測(cè)定當(dāng)我們構(gòu)建的酶電極浸入到電解溶液中時(shí)，待測(cè)底物

3、進(jìn)入酶層的內(nèi)部參與反應(yīng)，大部分酶反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生或消耗一種可被電極測(cè)定的物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，電活性物質(zhì)的濃度可以通過電位或電流模式進(jìn)行測(cè)定。五、 實(shí)驗(yàn)步驟 （1）電極處理：首先，將金電極分別用粒徑為1.0mm、0.3mm、0.05mm的氧化鋁粉末進(jìn)行打磨處理，直到電極表面呈現(xiàn)鏡面效果；其次，將打磨好的電極分別用水、無水乙醇、水超聲，各自超聲約3分鐘，用以去除電極表面可能存在的雜質(zhì)；最后，將超聲好的電極泡PR洗液，掃硫酸備用。處理三個(gè)電極，分別標(biāo)號(hào)為A、B、C。 （2）半胱胺的組裝：將（1）步制備好的電極浸泡于半胱胺溶液中，在室溫下靜置過夜，備用。 （3）戊二醛的組裝：將電極用PBS溶液沖洗干凈

4、,純氮微氣吹干，滴加5戊二醛，在 的恒溫器中組裝30 Min. （4）HRP的組裝：將（3）電極用PBS溶液沖洗干凈,純氮微氣吹干，其中標(biāo)號(hào)為A、B的電極，繼續(xù)滴加5辣根過氧化物酶，在的恒溫器中繼續(xù)組裝30Min. （5）電化學(xué)測(cè)量： PBS溶液為電化學(xué)測(cè)量時(shí)的電解液。將A、B、C兩根電極浸泡到PBS溶液中，在攪拌溶液的條件下施加一個(gè)-0.2V的電勢(shì)，測(cè)量電流-時(shí)間曲線，30s后依次往PBS溶液中加入濃度為10、20、30、50、100過氧化氫溶液，繼續(xù)測(cè)量電流-時(shí)間曲線，觀察、記錄實(shí)驗(yàn)過程中的情況。注：用來測(cè)定A、C電極電解液PBS溶液中，含有1 mM對(duì)苯二酚。六、問題討論 （1）酶電極有哪些組裝方法并分別進(jìn)行闡述（2）戊二醛的在實(shí)驗(yàn)中的作用是什么?（3）對(duì)苯二酚在電化學(xué)測(cè)量時(shí)有什么作用？ (4) 電化學(xué)分析方法有哪些？七、化學(xué)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) （1）酶電極在的恒溫器中組裝時(shí)，需要一定濕度的環(huán)境以保持酶的活性，所以，通常情況下我們將酶電