藥典三部版通則細菌內(nèi)毒素檢查法

1、1143細菌內(nèi)毒素檢查法本法系利用邕試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗結(jié)果為準。本試驗操作過程應防止內(nèi)毒素的污染。細菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示，1EU與1個內(nèi)毒素國際單位（IU）相當。細菌內(nèi)毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁邕試劑靈敏度、標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的效價，干擾試驗及檢查法中編號B和C溶液的制備、凝膠法中邕試劑

2、靈敏度復核試驗、光度測定法中標準曲線可靠性試驗。細菌內(nèi)毒素工作標準品系以細菌內(nèi)毒素國家標準品為基準標定其效價，用于干擾試驗及檢查法中編號B和C溶液的制備、凝膠法中邕試劑靈敏度復核試驗、光度測定法中標準曲線可靠性試驗。細菌內(nèi)毒素檢查用水應符合滅菌注射用水標準，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法），且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用。試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250C>30分鐘以上）去除，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明

3、無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器具。供試品溶液的制備某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時，可調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和邕試劑混合后溶液的pH值在6.08.0的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖溶液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。內(nèi)毒素限值的確定藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定：L=K/M式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性單位)表示；K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kgh)

4、表小，注射劑K=5EU/(kgh),放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kgh),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kgh);M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)或U/(kgh)表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按1.62nf計算。注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量(M)o按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。確定最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數(shù)(1-MVD),在不超過此稀釋倍數(shù)的

5、濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD:MVD=cL/入式中L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值；c為供試品溶液的濃度，當L以EU/mg或EU/U表示時，c的單位需為mg/ml或U/ml,當L以EU/ml表示時，則c等于1.0ml/ml。如需計算在MVD時的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=X/L人為在凝膠法中邕試劑的標示靈敏度(EU/ml),或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。方法1凝膠法凝膠法系通過邕試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理進行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒素的方法。邕試劑靈敏度復核試驗在本檢查法規(guī)定的條件下，使邕試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為邕試劑的標

6、示靈敏度，用EU/ml標示。當使用新批號的邕試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應進行邕試劑靈敏度復核試驗。根據(jù)邕試劑靈敏度的標示值（a,將細菌內(nèi)毒素國家標準品或細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2卜卜0.5人和0.25人四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒。取分裝有0.1ml邕試劑溶液的10m佛75mm試管或復溶后的0.1ml/支規(guī)格的邕試劑原安甑18支。其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕

7、輕混勻后，封閉管口，垂直放入37C+C的恒溫器中，保溫60分鐘及分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180。，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程中應避免收到振動，造成假陰性結(jié)果。當最大濃度2人管均為陽性，最低濃度0.25入管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為邕試劑靈敏度的測定值（人株入c=antilg（EX/n）式中X為反應終點濃度的對數(shù)值（lg）。反應終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度；n為每個濃度的平行管數(shù)。當入我0.52

8、入（包括0.5人和2入）時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度人為該批邕試劑的靈敏度。干擾試驗按表1制備溶液A、B、C和D,使用的供試品溶液應為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按邕試劑靈敏度復核試驗項下操作。表1凝膠法干擾試驗溶液的制備編R內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液一一一2B2入供試品溶液供試品溶液12482入1入0.5入0.25入4444C2入檢查用水檢查用水12入221入240.5入280.25入2D無/檢查用水一2注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為賞試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。只有

9、當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合邕試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方為有效。當系列濃度B的結(jié)果符合邕試劑靈敏度復核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。其他情況則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗?？赏ㄟ^對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進行干擾試驗。當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或

10、無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。當邕試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。檢查法凝膠限度試驗按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和Bo按邕試劑靈敏度復核試驗項下操作表2凝膠限度試驗溶液的制備內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液A無/供試品溶液2B2入供試品溶液2C2"檢查用水2D/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。結(jié)果判斷保溫60分鐘及分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B

11、的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。若供試品的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A出現(xiàn)不符合規(guī)定時，需將供試品稀釋至MVD重新實驗，再對結(jié)果進行判斷。凝膠半定量試驗本方法系通過確定反應終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按邕試劑靈敏度復核試驗項下操作。結(jié)果判斷若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供

12、試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.52入，試驗有效。系列溶液A中每一系列的終點稀釋倍數(shù)乘以為每個系列的反應終點濃度。如果檢驗的是經(jīng)稀釋的供試品，則將終點濃度乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度按公式CE=antilg（!2c/2若試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應記為內(nèi)毒素濃度小于入（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于人乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)）。若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值

13、時，則判定供試品不符合規(guī)定。當供試品溶液的所有平行管均為陽性，可記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以k表3凝膠半定量試驗溶液的制備編R內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水1248一一一一2222B2入供試品溶液12入2C2入檢查用水檢查用水12482入1入0.50.25入2222D無/檢查用水一一一2注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVDoB為2入濃度標準內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對照）。C為賞試劑標示靈敏度的對照系列。D

14、為陰性對照。方法2光度測定法光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測邕試劑與內(nèi)毒素反應過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法是依據(jù)反應混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度或透光率）之間存在的量化關系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度或透光率所需的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用檢測邕試劑與內(nèi)毒素反應過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法是依據(jù)反應混合物中內(nèi)毒素濃度和

15、其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關系來測定內(nèi)毒素含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反應混合物的吸光度或透光率達到某一預先設定的檢測值所需要的反應時間，或檢測值增加速度的方法。光度測定試驗需在特定的儀器中進行，溫度一般為37c蟲Co供試品和邕試劑的加樣量、供試品和邕試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進行標準曲線的可靠性試驗以及供試品的干擾試驗。標準曲線的可靠性試驗當使用新批號的邕試劑或試驗條件有任何可能會影響檢驗結(jié)果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。用標準內(nèi)毒素制成溶液，制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于

16、10倍），最低濃度不得低于所用邕試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性對照，當陰性對照的吸光度或透光率小于標準曲線最低點的檢測值或反應時間大于標準曲線最低點的反應時間，將全部數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標準曲線的相關系數(shù)（r）的絕對值應大于或等于0.980,試驗方為有效。否則須重新試驗。干擾試驗選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)毒素濃度（設為加），作為供試品干擾試驗中添加的內(nèi)毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。表4光度測定法干擾試驗溶液的制備編R內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液至少2B標準曲線的中點（或附

17、近點）的濃度（設為加）供試品溶液至少2C至少3個濃度（最彳點設定為a檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少2注：A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液。B為加入了標準曲線中點或靠近中點的一個已知內(nèi)毒素濃度的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。C為如“標準曲線的可靠性試驗”項下描述的，用于制備標準曲線的標準內(nèi)毒素溶液。D為陰性對照。按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs,再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）R=(cs-ct)/RX100%當內(nèi)毒素的回收率在50%200%,則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。當內(nèi)毒素的回收率不在指定的范圍內(nèi)，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素，并重復干擾試驗來驗證處理的有效性。當邕試劑、供試品的來源、處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。檢查法按“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。使用系列溶液