‘云香’水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析

1、云香水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析 2.5 NtNAC1轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 隨機選擇12株抗性植株，稀釋其DNA至同一濃度，PCR擴增19號泳道出現(xiàn)約1000 bp特異性條帶，與重組質(zhì)粒長度一致，獲得9株陽性株系。GUS染色顯示，陽性株系呈現(xiàn)藍色且維管束部分顏色較深。以上結(jié)果均說明云香NtNAC1已勝利導(dǎo)入煙草中，選取條帶光明的2、3、9號株系繼續(xù)培育，用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因植株的功能鑒定。2.6 NtNAC1轉(zhuǎn)基因煙草株系抗逆性鑒定T1代陽性株系根長試驗發(fā)覺，正常生長條件下對比組1/2 MS，野生型與轉(zhuǎn)基因植株根長無明顯差異。模擬逆境脅迫下根長均受到不同程度的抑制，野生型植株根系伸長嚴(yán)峻受阻

2、，其中ABA處理后，植株根長小于10 mm受抑制程度最嚴(yán)峻，甘露醇、NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系根長較野生型發(fā)育良好，這說明NtNAC1過表達增添了轉(zhuǎn)基因煙草根系對ABA的敏感性和對干旱、高鹽的耐受性。煙草植株WT和3個轉(zhuǎn)基因株系TP-2、TP-3、TP-934葉期時進行抗逆性鑒定，對比組正常生長條件，過表達NtNAC1轉(zhuǎn)基因植株和野生型表型無顯著差異;試驗組15 d脅迫處理后發(fā)覺，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草相較對比組生長發(fā)育緩慢，葉片外表積小，野生型植株葉片開始變黃，而轉(zhuǎn)基因植株長勢良好;鹽脅迫下大部分植株葉片萎蔫發(fā)黃，甚至枯萎，野生型枯萎速度高于轉(zhuǎn)基因植株，說明水仙NtNAC1過表達減輕了逆境脅迫

3、產(chǎn)生的損害，提高了煙草的抗性。不同小寫字母表示在相同組織中不同處理時間點的差異顯著性P0.05。3 商量NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，參加響應(yīng)高鹽、干旱、低溫或高溫等非生物脅迫，其基因功能的多效性在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中特別有益，即通過轉(zhuǎn)變1個NAC基因的表達實現(xiàn)多種定向改進15，因此克隆和鑒定優(yōu)良非生物脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子具有重要意義。云香水仙較其他多花水仙品種抗性強16，本討論利用RT-PCR技術(shù)從云香水仙中克隆了1個新的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因NtNAC1，其編碼的蛋白與同一品種云香NtNAC3153蛋白相像性低，在C端幾乎沒有相同的殘基，說明兩者分化較久，在功能上可能有所分化。這一現(xiàn)象也出如今其他

4、植物中，包括擬南芥AtNAM17、大豆GmNAC1618、陸地棉GhNAC1619、鷹嘴豆CarNAC1620等。進化樹分析結(jié)果，NtNAC1聚分在SNAC1亞家族。同一亞家族中，小麥TaNAC47在擬南芥中過表達時增加了植株對外源ABA的敏感度，增添了對干旱、鹽和低溫脅迫的耐受性21;香蕉MusaSNAC1通過提高干旱脅迫下保衛(wèi)細胞中H2O2含量來誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，削減水分損失，從而提高過表達株系的抗旱性22。由此，可推想NtNAC1與這些蛋白具有相像功能，即響應(yīng)逆境脅迫，提高植株的抗性。本討論中，NtNAC1的表達水平主要受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG脅迫誘導(dǎo)，具有時空特

5、異性。這一表達模式不僅與云香NtNAC3153相像，即均能被ABA、高鹽誘導(dǎo)NtNAC1峰值表達量高于NtNAC3153，其基因功能可能更強大，還與SNAC1亞家族其他植物基因類似，例如，擬南芥ANAC019、ANAC072在葉和根中高表達，鹽脅迫下葉和根中的表達量上調(diào)23;小麥TaNAC29、TaNAC2D在葉中高表達，根中表達量相對較低，鹽、干旱、ABA等非生物脅迫下葉和根中的表達量均急劇上升24;小麥TaNAC47受ABA、4 、PEG、高鹽脅迫誘導(dǎo)表達21。明顯，抗逆基因的可誘導(dǎo)性有利于植物快速響應(yīng)不同的逆境，增加在逆境下的生存能力。本文發(fā)覺，NtNAC1的表達具有時空特異性，比方在根中表達量高、葉中次之;在花瓣和副冠中的表達模式也不同，除可能與這些組織或器官的發(fā)育階段不同對逆境的抵抗力不同這一解釋外，我們不能排除該基因還有其他潛在的生物學(xué)功能。大量討論說明，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將NAC過表達，能不同程度地提高對非生物脅迫的耐受性。如，小麥TaRNAC1在根系過量表達，可以促進根發(fā)育、增加生物量和產(chǎn)量，提高抗旱性25;陸地棉GhNAC79過表達提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥、棉花的抗旱性26;鷹嘴豆CarNAC6在擬南芥中過表達，促進轉(zhuǎn)基因植株根系生長，提高其對干旱和高鹽的耐受性27。本討論同樣發(fā)覺，接受農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水仙NtNAC1轉(zhuǎn)入煙草中過表達，促進了轉(zhuǎn)基